Mekanismer for aterogenese i post-prandial tid i fedme hos børn

Nogle af tidligere skitser af forholdet mellem forstørret fedtmasse og insulinresistens er ikke blevet bevist eksperimentelt hos mennesker. For eksempel er de fleste af relationerne vist hos mennesker mellem cytokiner og insulinfølsomhed korrelationsobservationer.

Hos det overvægtige barn er fedtlever ret udbredt og er tættere forbundet end andre fedtdepoter til insulinresistens, dyslipidæmi, forhøjet blodtryk og til høje niveauer af inflammationsmarkører. Hele billedet er derfor i overensstemmelse med en accelereret drift til åreforkalkning hos det overvægtige barn/unge. Faktisk har adskillige rapporter vist, at mellemliggende fænotyper af åreforkalkning kan påvises hos det overvægtige barn. Desuden menes den post-prandiale fase at spille en egen rolle i atherogenese.

Forskerne antager, at hos overvægtige insulinresistente børn aktiveres atherogenesemekanismer, såsom hyperlipæmi, oxidant-stress og sub-inflammation, i den post-prandiale fase, hvilket resulterer i svækkelse af vaskulær funktion.

Parametre under undersøgelse:

1. Kandidatudløsende agenter

   • Post-prandial glukose
   • Post-prandial hyperlipæmi
   • Post-prandial lille tæt LDL
   • Post-prandial insulin
   • Kandidatmekanismer
   • Komplementaktivering
   • C3

2. Betændelse

   • TNF-alfa
   • Interleukin-6 (IL-6)
   • Interleukin-10 (IL-10)
   • C-reaktivt protein (CRP)
   • Oxidant stress
   • Urin-iso-PGF2-alfa

3. Mellemliggende fænotyper

   • Carotis artery intima-media thickness (IMT) (kun ved baseline)
   • Endotelfunktion (flow-medieret vasodilation) (FMD)
   • Arteriel stivhed (pulsbølgehastighed) (PWV)

Eksperimentel protokol Forsøgspersoner vil ankomme til afdelingen for endokrinologi og metaboliske sygdomme på Verona City Hospital kl. 0800 efter faste natten over. Vægt, højde, taljeomkreds og blodtryk vil blive målt. Under hele undersøgelsen vil forsøgspersonerne ligge i sengen i et stille, temperaturstyret (22 °C) rum. Et Teflon venekateter vil blive indsat i en antecubital vene til blodprøvetagning og vil blive holdt åbent med en normal saltvandsinfusion med langsomt dryp. Baseline tilstand vil blive betragtet som opnået efter mindst 20 minutters hvile i sengen efter venepunktur.

Forsøgspersoner må ikke have været på medicin, der vides at interferere med vaskulær funktion i mindst 2 uger og vil blive bedt om at afstå fra koffeinholdige drikkevarer i mindst 24 timer før undersøgelsen. Systolisk blodtryk, diastolisk blodtryk, middelarterielt tryk og hjertefrekvens vil blive overvåget med tidsintervaller med Cardiocap II (Datex, Finland) gennem hele undersøgelsen.

Carotis-femoral PWV vil blive vurderet ved hjælp af Complior (Colson, Garges les Genosse, Frankrig). Carotis arterie IMT vil blive vurderet ved høj opløsning amerikansk farve-doppler scanning. Derefter vil flow-medieret endotelafhængig vasodilatation af den ikke-dominante fælles femorale arterie blive vurderet ved højopløsnings ekko-doppler (Esaote Biomedica AU6, Genova, Italien) med en 10 MHz lineær vaskulær probe med aksial opløsning på 0,01 mm. Basislinjediameter og blodgennemstrømningshastighed, en proxy for forskydningsspænding, vil blive vurderet i det mindste tredobbelt. Herefter sættes en sphygmomanometrisk manchet under knæet og pustes op 50 mm Hg højere end det systoliske blodtryk og opretholdes i 5'. Kardiameter og strømningshastighed vil blive målt på tidspunktet 0,5', 2', 4', 6' og 8' efter at manchetten er tømt for luft i henhold til efterforskernes veletablerede protokol. Under disse betingelser vil postiskæmisk hyperæmi, når manchetten er tømt, finde sted i vævene, som er distale for den sphygmomanometriske manchet. Denne hyperæmi vil inducere en stigning i blodgennemstrømningshastigheden af ​​den fælles lårbensarterie, som er placeret proksimalt til manchetten. Stigningen i strømningshastighed og den deraf følgende stigning i forskydningsspænding fremkalder en endotelafhængig vasodilatation. Det har vist sig, at denne udvidelse er NO-afhængig. Et globalt kvantitativt indeks for flowafhængig vasodilatation vil blive opnået ved at beregne arealet under kurven for ændring i kardiameter som funktion af tiden (8 min observation), udtrykt både som absolutte værdier og som procentvise ændringer over kardiameterens basislinje . I efterforskernes hænder er variationskoefficienten mellem dage for denne teknik (n=15, der dækker en bred vifte af vaskulær respons) 23,0±3,8%. Endotel-uafhængig vasodilatation vil ikke blive evalueret, fordi administration af glyceryltrinitrat til forskningsformål anses for etisk uforsvarlig hos børn af den lokale institutionelle etiske komité.

I efterforskernes nuværende erfaring (n=42 svært overvægtige børn) er den gennemsnitlige mund- og klovsyge efter faste natten over 1,40±0,91 % pr. 8 minutter (middel±SD), hvorved der efterlades betydelig plads til at vise dynamiske ændringer. Hos disse svært overvægtige børn fandt disse efterforskere ingen sammenhæng mellem MKS og BMI. En ad hoc mekanisk amerikansk probeholder vil blive ansat i de nuværende parrede undersøgelser med det formål at hjælpe med at øge reproducerbarheden af ​​teknikken. Desuden vil en specifik automatisk kontursporingsteknik til automatisk beregning af ændringerne i arteriel diameter blive brugt for at minimere operatørens afhængighed af denne metode.

Baseline (-10 min og 0') blodprøver vil blive indsamlet for at måle glucose, insulin, C-peptid, standard lipidprofil (total kolesterol, HDL-kolesterol og triglycerider), oxideret-LDL, adiponectin, leptin, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 og CRP ved mikrometoder for at begrænse blodtab. En separat prøve vil blive indsamlet for at måle LDL- og HDL-underfraktioner. Baseline urin vil blive indsamlet for at måle iso-PGF2-alpha, et produkt afledt af ikke-enzymatisk lipidperoxidation, katalyseret af frie oxygenradikaler på cellemembraner og LDL-partikler (43).

På tidspunktet 0' vil forsøgspersoner indtage et blandet flydende måltid (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) med kendt kalorieindhold (300 kcal pr. m2 kropsoverflade) og sammensætning (53,8 % kulhydrater, 29,5 % lipider, 16,7 % proteiner) over 10 minutter. Glucose, insulin og C-peptid vil blive målt ved +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' og +300'. Standardlipider og PWV vil blive målt ved +60', +120', +180', +240' og +300'. Adiponectin, leptin, C3, TNF-alpha, IL-6, IL-10, CRP og LDL og HDL subfraktioner vil blive målt ved +180' og +300'. På tidspunktet vil +180' vurdering af MKS blive gentaget. Ved slutningen af ​​måltidstesten vil der blive opsamlet urin for at vurdere 8-iso-PGF2-alfa.

Blodprøver vil hurtigt blive centrifugeret ved 1500 g ved +4 °C, plasma/serum vil blive opsamlet og opbevaret ved -80 °C. Urinprøver vil blive opbevaret ved -80 °C. Totalt blodtab vil blive holdt under 100 cc.

Analytiske metoder Bortset fra vurdering af LDL/HDL-subfraktion og urin PGF2alpha, vil metoder, der er specifikt optimeret til at bruge små mængder plasma/serum, blive brugt til at minimere blodtab. Glucose vil blive målt ved sengen med en Yellow Spring Glucose Analyzer ved hjælp af glucoseoxidasemetoden. C-peptid og insulin vil blive målt ved in-house ELISA mikrometoder. Total- og HDL-kolesterol og totale triglycerider vil blive vurderet ved hjælp af standard in-house enzymatiske mikrometoder. Adiponectin, leptin, C3, TNF-alpha, IL-6, IL-10, CRP vil blive vurderet ved in-house immunometriske mikrometoder. 8-Iso-PGF2alpha vil blive vurderet ved et immunometrisk assay efter ekstraktion fra urin.

LDL/HDL-underfraktioner vil blive målt i laboratoriet hos prof. Alberto Zambon, ved University of Padua School of Medicine. Kort fortalt, efter at have skabt en diskontinuerlig saltdensitetsgradient i et ultracentrifugerør, vil prøverne blive centrifugeret ved 65.000 rpm i 90 minutter ved 10°C i en Sorvall TV-865B lodret rotor. 38 0,45 ml fraktioner opsamles derefter fra bunden af ​​centrifugerøret. Kolesterol måles i hver fraktion. Den relative flotationshastighed (Rf), som karakteriserer LDL-top-opdrift og er et mål for LDL-størrelse/-densitet, opnås ved at dividere fraktionstallet, der indeholder LDL-kolesteroltoppen, med det samlede antal opsamlede fraktioner.

Vurdering af beta-celle funktion

Beta-cellefunktion vil blive evalueret ved at analysere glukose- og C-peptidkurverne under testen med blandet måltid i henhold til den generelle strategi foreslået af flere laboratorier med nogle små modifikationer. Kort fortalt er insulinsekretion summen af ​​tre komponenter:

1. basale (postabsorptive) insulinsekretionshastigheder;
2. insulinsekretion som reaktion på stigningshastigheden i plasmaglucose ("dynamisk" eller "derivat" sekretionskomponent);
3. insulinsekretion som reaktion på de faktiske glucoseniveauer over den postabsorptive glucosekoncentration ("statisk" eller "proportional" sekretionskomponent).

En komplet beskrivelse af modelleringsstrategien kan findes i efterforskernes tidligere publikationer. Parametre vil blive estimeret ved at implementere denne minimale model for C-peptidsekretion i SAAM 1.1.2 software (SAAM Institute, Seattle, WA). Numeriske værdier af de ukendte parametre vil blive estimeret ved at bruge ikke-lineære mindste kvadrater.

Vægte vælges optimalt, dvs. lig med det omvendte af variansen af ​​målefejlene, som antages at være additive, ukorrelerede, med nul middelværdi og en konstant variationskoefficient (CV) på 8 %.

Denne analyse vil give det hormonelle scenarie, hvor de postprandiale aterogenetiske processer finder sted.

Statistisk analyse Data vil blive opsummeret som middel±SEM. Størrelsen af ​​stikprøven (n=20 i hver gruppe) er udvalgt med det formål at have 80 % chance for at opnå statistisk signifikans for forskelle på 20-40 % (den mindste påviselige forskel varierer fra variabel til variabel under undersøgelse). Den generelle estimeringsligningsprocedure (GEE) vil blive brugt til at køre 2-vejs ANOVA for gentagne målinger og til at justere for kovariater, hvis det er nødvendigt. Gaussisk fordeling vil blive testet i alle variabler, og hvis der findes statistisk signifikante afvigelser fra normalitet, vil logaritmisk (eller anden) transformation blive anvendt. Korrelationer vil blive søgt af Spearmans rangkorrelationskoefficient. Statistisk signifikans vil blive erklæret til p<0,05. Statistiske analyser vil blive udført ved hjælp af SPSS 12.0 (eller højere) til MacOS X.

At nå målene for dette forskningsprojekt vil:

1. udbygge viden om sammenhængen mellem fedme i barndommen, inflammation, insulinresistens og vaskulær dysfunktion;
2. belyse, om postprandial hyperlipæmi, postprandial inflammation og/eller postprandial oxidant-stress er forbundet med mellemliggende fænotyper af aterosklerose hos det overvægtige barn/teenager;
3. etablere potentielle nye mål for forebyggelse af fedmekomplikationer hos barnet/den unge og potentielt angive nye værktøjer til behandling af fedmerelaterede forstyrrelser.