ヒト健常者由来のリンパ芽球様細胞株における遺伝子発現レベルに対する in vivo リチウム治療効果

バックグラウンド

精神医学研究の主な制限の 1 つは、神経機能を研究するために間接的な方法を使用する必要があることです。 これらの中でも、形質転換リンパ球の研究は非常に貴重なツールです。 エプスタイン バー ウイルス (EBV) 形質転換リンパ芽球は、遺伝子発現の in vitro 研究や薬理学的治療に対する細胞応答の調査など、さまざまな目的に使用できます。 それらは必要に応じて保持および再成長させることができ、遺伝子解析用の DNA のバックアップ供給源として役立つことがよくあります。 これらの理由から、リンパ芽球細胞株 (LCL) が収集され、私たち自身を含む多くの研究グループによって使用されてきました。

ほとんどの研究者は、そのような形質転換された細胞がその人の特徴と病気を表しているという暗黙の仮定を持って研究を行っています。 言い換えれば、細胞の形質転換と継代の繰り返しにより、採血とリンパ球の分離時に存在する交絡因子の影響が軽減されると考えられます。 これらの要因には、とりわけ、臨床状態、実際の治療、または時刻が含まれる場合があります。 驚くべきことに、この仮定を支持または否定する公開データを見つけることができませんでした。

ここでは、さまざまな細胞対策、つまり in vivo 薬物治療に影響を与える可能性のある特定の要因の影響を調査することを提案します。 具体的には、気分安定特性を持つイオンであるリチウムによる治療の効果を評価することに関心があります。 実際、リチウムは双極性障害の最も効果的な治療法であり、約 30% の患者が完全な病気の寛解とエピソードの再発の予防を達成しています (Baldessarini and Tondo, 2000; Garnham et al., 2007)。

根拠

リチウムは、特定の標的遺伝子の発現に対する調節効果を確立しています。 リチウム治療に対する反応が特徴付けられた患者の LCL に関する遺伝子発現研究により、この薬剤によって直接調節される一連の分子標的が特定されました。 リチウムに対する完全な反応を特徴とする BD 患者の LCL に関するマイクロアレイ研究 (Sun et al., 2004) では、7 つの遺伝子の発現を減少させる効果が実証されました。 (NF-kB)、アルファ 1B アドレナリン受容体 (1B-AR)、アセチルコリン受容体タンパク質アルファ鎖前駆体 (ACHR)、cAMP 依存性 3', 5'-サイクリック ホスホジエステラーゼ 4D (PDE4D)、サブスタンス P 受容体 (SPR)、およびras 関連タンパク質 (RAB7)、後者の 5 つはノーザンブロット分析によって検証されています。 最近、3 人の健康な被験者の LCL を使用して、Sugawara と共同研究者 (2010) は、リチウムによって発現が調節される 44 の遺伝子を特定しました。 リチウムによって最もダウンレギュレートされた 10 個の遺伝子の中には、Bax、ズオチン関連因子 1 (ZRF1)、および 13 を含むチオレドキシン ドメイン (TXNDC13) があり、一方、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、アイソフォーム Ib、ベータ サブユニット 30 kDa (PAFAH1B2)、滑膜肉腫転座、染色体 18 (SS18) およびペルオキシソーム生合成因子 1 (PEX1) が最もアップレギュレートされました。 さらに、鷲塚ら。 (2009) は、日本人の BD 患者の LCL において、リチウムではなくバルプロ酸が、ミトコンドリア複合体 I (NDUFV2) のサブユニットをコードする遺伝子の発現を有意に増加させることを示しました。 他の精神医学的表現型に関して、自殺行動のさまざまなリスクを特徴とする BD 患者の LCL からの未発表データは、in vitro リチウム治療が律速酵素スペルミジン/スペルミン N(1)-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を著しく乱したことを示しています。 (SAT1) (Squassina et al.、準備中)。

遺伝子発現研究に加えて、LCL は BD 被験者のタンパク質レベルに対するリチウムの影響を調査するためにも使用されています。 Tseng らの研究。 (2008) 彼らの影響を受けていない親戚と健康な対照参加者の両方と比較した場合、基礎 BDNF タンパク質レベルがリチウム応答性 BD 患者からの LCL で減少することを明らかにしました。 興味深いことに、LCL のリチウムによる in vitro 治療は、すべての参加者の BDNF レベルを低下させましたが、BD 患者と健康な対照との差は残っていました。

さらに、遺伝子およびタンパク質発現に対するリチウムの多面的効果は、動物を使用した一連の研究で深く調査されています (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) およびヒト (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) の細胞組織。

具体的には: 1) リチウムは、抗アポトーシス遺伝子 BCL2 の発現を増加させ、アポトーシス促進遺伝子 p53 および Bax の発現を減少させることが示されており (Chen et al., 1999)、分子カスケードに影響を与える役割を明確に示しています。プログラムされた細胞死を調節します。 この証拠は、BCL2 に関する最近の発見に照らして特に関心を集めています。 最近の 2 つの研究 (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) は、BD 患者において、一塩基多型 (SNP) rs956572 によって調節される BCL2 遺伝子発現が、細胞内 Ca2+ ホメオスタシス調節不全、分子のシグナル伝達経路は、BD の病因に重要な役割を果たすことが証明されました。 2) リチウムと共に培養された複数のヒト前立腺癌細胞株でゲノムワイド遺伝子発現アプローチ (GWGE) を使用して、Sun と共同研究者 11 は、DNA 複製に関与する遺伝子の顕著なダウンレギュレーションを示しました。 別の研究では、Seelan 等。 (2008) は、マイクロアレイを用いてヒト神経細胞におけるリチウム調節遺伝子発現のプロファイリングを試み、抗酸化酵素であるペルオキシレドキシン 2 (PRDX2) を最もアップレギュレートされた遺伝子として同定し、トリブルホモログ 3 (TRB3) をアポトーシス促進因子として同定しました。タンパク質は、最もダウンレギュレートされており、気分安定プロセスにおけるこれらの経路の役割をさらに示唆しています.

要約すると、リチウムは多くの遺伝子の発現の大きさを大幅に調節することが証明されており、その中で最も堅牢で複製された変化は BCL2、BAX、p53、および SAT1 でした。 したがって、これらの遺伝子およびタンパク質の発現を重要かつ安定した方法で調節するというリチウムの確立された特性を利用することができます。 逆に、これらの遺伝子は、遺伝子発現に対するリチウムの影響のマーカーとして使用でき、in vivo 治療効果を排除する際の EBV 不死化と継代の繰り返しの有効性を調査するための手段を提供します。

試験の目的

この提案は、EBV の不死化と継代の繰り返しによる LCL が、サンプリング時の環境条件、特に薬物治療の影響を受けないという仮定を検証することを目的としています。

そうするために、新鮮なリンパ球と LCL は、安定した用量でのリチウム治療の 4 週間前 (T0) と後 (T1) に、20 人の健康なボランティアでサンプリングされます。

最初に、新鮮なリンパ球の一連の分子研究では、標的遺伝子 (すなわち、BCL2、BAX、p53、SAT1) とタンパク質 (BDNF) の発現レベル、および複合体 I の活性 (すでに知られているすべての生物学的測定値が上昇している) を調べます。 /T0 および T1 でリチウムによってダウンレギュレートされます。 これらの生物学的対策は、アッセイ感度として機能します。 それらは in vivo リチウム治療によって調節され、その結果、新鮮なリンパ球の T0 と T1 の間で有意に異なると予想されます。

次に、新鮮なリンパ球 (EBV で形質転換されていない) で有意差を示す生物学的測定のみを LCL で分析します。 T0 と T1 でサンプリングされた LCL 間の差次的発現は、EBV 変換と繰り返し通過が環境の影響、特にサンプリング時のリチウム処理の影響を排除しないことを示します。

最後に、健康なボランティアを研究することにより、病気の状態の存在によって与えられる交絡因子を減らすことが期待されます.