Effekter av in vivo litiumbehandling på genekspresjonsnivåer i lymfoblastoidcellelinjer fra friske mennesker

Bakgrunn

En av de største begrensningene ved psykiatrisk forskning er nødvendigheten av å bruke indirekte metoder for å studere nevronale funksjoner. Blant disse er studier av transformerte lymfocytter et uvurderlig verktøy. Epstein Barr-virus (EBV) transformerte lymfoblaster kan brukes til en rekke formål, inkludert in vitro-studier av genuttrykk og undersøkelser av cellulære responser på farmakologisk behandling. De kan beholdes og dyrkes på nytt etter behov og kan ofte tjene som en reserveforsyning for DNA for genetiske analyser. Av disse grunner har lymfoblastcellelinjer (LCL) blitt samlet inn og brukt av en rekke forskningsgrupper, inkludert vår egen.

De fleste etterforskere arbeider med den implisitte antakelsen om at slike transformerte celler representerer karaktertrekk ved personen og deres sykdom. Med andre ord antas celletransformasjonen og gjentatte passasjer å redusere virkningen av eventuelle forstyrrende faktorer som er tilstede på tidspunktet for blodprøvetaking og lymfocyttisolering. Disse faktorene kan inkludere blant annet den kliniske tilstanden, den faktiske behandlingen eller tidspunktet på dagen. Overraskende nok kunne vi ikke finne noen publiserte data som støtter eller motsier denne antakelsen.

Her foreslår vi å undersøke effekten av en bestemt faktor som kan påvirke ulike cellulære tiltak, nemlig in vivo medikamentell behandling. Konkret er vi interessert i å vurdere effekten av behandling med litium, et ion som har stemningsstabiliserende egenskaper. Litium er faktisk den mest effektive behandlingen ved bipolar lidelse, med omtrent 30 % av pasientene som oppnår fullstendig sykdomsremisjon og forebygging av tilbakefall av episoder (Baldessarini og Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Begrunnelse

Litium har veletablerte regulatoriske effekter på ekspresjonen av spesifikke målgener. Genekspresjonsstudier på LCL fra pasienter karakterisert for respons på litiumbehandling har identifisert en serie molekylære mål som er direkte modulert av dette stoffet. En mikroarray-studie (Sun et al., 2004) på ​​LCL-er av pasienter med BD karakterisert for full respons på litium demonstrerte dens effekt i å redusere ekspresjonen av syv gener: somatostatinreseptor type 2 (SSTR2), nukleær faktor kappa-B DNA-bindende underenhet (NF-kB), alpha1B-adrenoceptor (1B-AR), acetylkolinreseptorprotein alfakjedeforløper (ACHR), cAMP-avhengig 3', 5'-syklisk fosfodiesterase 4D (PDE4D), substans-P reseptor (SPR), og ras-relatert protein (RAB7), de fem sistnevnte ble validert ved Northern blotting-analyse. Nylig, ved å bruke LCL fra tre friske forsøkspersoner, identifiserte Sugawara og medarbeidere (2010) 44 gener hvis uttrykk ble regulert av litium. Blant de ti genene som er mest nedregulert av litium var Bax, zuotin-relatert faktor 1 (ZRF1) og tioredoksindomene inneholdende 13 (TXNDC13), mens blodplateaktiverende faktor acetylhydrolase, isoform Ib, beta-underenhet 30 kDa (PAFAH1B2), Synovial translokasjonssarkom , kromosom 18 (SS18) og peroksisom biogenesefaktor 1 (PEX1) var de mest oppregulerte. Dessuten har Washizuka et al. (2009) viste at valproat, men ikke litium, signifikant økte ekspresjonen av genet som koder for en underenhet av mitokondrielt kompleks I (NDUFV2) i LCL fra japanske BD-pasienter. Når det gjelder andre psykiatriske fenotyper, viser upubliserte data fra LCL-er fra BD-pasienter karakterisert for ulik risiko for selvmordsatferd at in vitro litiumbehandling forstyrret uttrykket av genet som koder for det hastighetsbegrensende enzymet spermidin/spermin N(1)-acetyltransferase betydelig. (SAT1) (Squassina et al., under forberedelse).

Foruten genekspresjonsstudier, har LCL-er også blitt brukt til å undersøke effekten av litium på proteinnivåer hos BD-personer. Studien fra Tseng et al. (2008) avslørte at basale BDNF-proteinnivåer er redusert i LCL fra litium-responsive BD-pasienter sammenlignet med både deres upåvirkede slektninger og med friske kontrolldeltakere. Interessant nok reduserte in vitro-behandling med litium av LCL-ene BDNF-nivåer hos alle deltakerne, men forskjellen mellom BD-pasienter og friske kontroller forble.

I tillegg er den pleiotrope effekten av litium på gen- og proteinekspresjon blitt grundig undersøkt i en seriestudier med dyr (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) og humant (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) cellevev.

Spesifikt: 1) Litium har vist seg å øke ekspresjonen av det anti-apoptotiske genet BCL2 med reduksjon av ekspresjonen av de pro-apoptotiske genene p53 og Bax (Chen et al., 1999), noe som tydelig indikerer en rolle i å påvirke den molekylære kaskaden regulerer den programmerte celledøden. Dette beviset får særlig interesse i lys av nylige funn på BCL2. To nyere studier (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) viste at BCL2-genekspresjon regulert av single nucleotide polymorphism (SNP) rs956572 hos individer med BD direkte påvirket intracellulær Ca2+ homeostase dysregulering, en føflekk. signalvei viste seg å spille en betydelig rolle i patogenesen av BD. 2) Ved å bruke en genombredt genuttrykkstilnærming (GWGE) på flere humane prostatakreftcellelinjer som ble inkubert med litium, viste Sun og medarbeidere 11 en markant nedregulering av gener involvert i DNA-replikasjon. I en annen studie har Seelan et al. (2008), i forsøket på å profilere det litiummodulerte genuttrykket i humane nevronceller med mikroarray, identifiserte peroksiredoksin 2 (PRDX2), et antioksidantenzym, som det mest oppregulerte genet, og tribler homolog 3 (TRB3), et pro-apoptotisk middel. protein, som det mest nedregulerte, noe som ytterligere antyder en rolle for disse banene i stemningsstabiliseringsprosessen.

Oppsummert har litium vist seg å modulere betydelig omfanget av uttrykket av en rekke gener, blant dem de mest robuste og replikerte endringene var for BCL2, BAX, p53 og SAT1. Dermed kan vi dra nytte av litiums veletablerte egenskap til å regulere uttrykket av disse genene og proteinene på en betydelig og stabil måte. Motsatt kan disse genene brukes som markører for effekten på litium på genuttrykket, og gir et mål for undersøkelse av effektiviteten av EBV-immortalisering og gjentatte passasjer for å eliminere in vivo-behandlingseffektene.

Prøvemål

Dette forslaget tar sikte på å validere antakelsen om at LCL-er, via EBV-immortalisering og gjentatte passasjer, ikke er påvirket av miljøforhold, og spesielt medikamentell behandling, på prøvetakingstidspunktet.

For å gjøre dette, vil ferske lymfocytter og LCL-er tas fra 20 friske frivillige før (T0) og etter (T1) fire ukers litiumbehandling i en stabil dose.

Først vil et sett med molekylære studier i ferske lymfocytter undersøke ekspresjonsnivåene i målgener (nemlig BCL2, BAX, p53, SAT1) og protein (BDNF), og aktiviteten til kompleks I (alle biologiske mål som allerede er kjent for å være opp- /nedregulert av litium) ved T0 og T1. Disse biologiske målene vil tjene som en analysefølsomhet. Vi forventer at de blir regulert av in vivo litiumbehandling og følgelig være signifikant forskjellig mellom T0 og T1 i ferske lymfocytter.

Bare de biologiske målene som viser signifikant forskjell i ferske lymfocytter (ikke transformert med EBV) vil deretter bli analysert i LCL. Differensielt uttrykk mellom LCL-prøver ved T0 og T1 vil indikere at EBV-transformasjonen og gjentatte passasjer ikke eliminerer miljøpåvirkningene og spesifikt effekten av litiumbehandling ved prøvetaking.

Til slutt, ved å studere friske frivillige, forventer vi å redusere de forstyrrende faktorene gitt av tilstedeværelsen av sykdomsstatus.