In vivo lithiumbehandlingseffekter på genekspressionsniveauer i lymfoblastoide cellelinjer fra sunde mennesker

Baggrund

En af de største begrænsninger ved psykiatrisk forskning er nødvendigheden af ​​at bruge indirekte metoder til at studere neuronale funktioner. Blandt disse er undersøgelser af transformerede lymfocytter et uvurderligt værktøj. Epstein Barr virus (EBV) transformerede lymfoblaster kan anvendes til en række formål, herunder in vitro undersøgelser af genekspression og undersøgelser af cellulære responser på farmakologisk behandling. De kan holdes og gendyrkes efter behov og kan ofte tjene som backup-forsyning til DNA til genetiske analyser. Af disse grunde er lymfoblastcellelinjer (LCL'er) blevet indsamlet og brugt af en række forskningsgrupper, herunder vores egen.

De fleste efterforskere arbejder med den implicitte antagelse, at sådanne transformerede celler repræsenterer karakteristika for personen og deres sygdom. Med andre ord antages celletransformationen og gentagne passager at reducere virkningen af ​​eventuelle forstyrrende faktorer, der er til stede på tidspunktet for blodprøvetagning og lymfocytisolering. Disse faktorer kan blandt andet omfatte den kliniske tilstand, den faktiske behandling eller tidspunktet på dagen. Overraskende nok kunne vi ikke finde nogen offentliggjorte data, der understøtter eller modsiger denne antagelse.

Her foreslår vi at undersøge virkningerne af en bestemt faktor, der kan påvirke forskellige cellulære foranstaltninger, nemlig in vivo lægemiddelbehandling. Konkret er vi interesseret i at vurdere effekten af ​​behandling med lithium, en ion, der besidder stemningsstabiliserende egenskaber. Lithium er faktisk den mest effektive behandling ved bipolar lidelse, hvor cirka 30 % af patienterne opnår fuldstændig sygdomsremission og forebyggelse af tilbagefald af episoder (Baldessarini og Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Begrundelse

Lithium har veletablerede regulatoriske virkninger på ekspressionen af ​​specifikke målgener. Genekspressionsundersøgelser på LCL'er fra patienter karakteriseret for respons på lithiumbehandling har identificeret en række molekylære mål, der er direkte moduleret af dette lægemiddel. Et mikroarray-studie (Sun et al., 2004) på ​​LCL'er af patienter med BD karakteriseret for fuld respons på lithium demonstrerede dets effekt med hensyn til at reducere ekspressionen af ​​syv gener: somatostatinreceptor type 2 (SSTR2), nuklear faktor kappa-B DNA-bindende underenhed (NF-kB), alpha1B-adrenoceptor (1B-AR), acetylcholinreceptorprotein alfakædeprecursor (ACHR), cAMP-afhængig 3', 5'-cyklisk phosphodiesterase 4D (PDE4D), substans-P-receptor (SPR) og ras-relateret protein (RAB7), hvor sidstnævnte fem er valideret ved Northern blotting-analyse. For nylig identificerede Sugawara og kolleger (2010) 44 gener, hvis ekspression blev reguleret af lithium, ved hjælp af LCL'er fra tre raske forsøgspersoner. Blandt de ti gener, der er mest nedreguleret af lithium, var Bax, zuotin-relateret faktor 1 (ZRF1) og thioredoxin-domæne indeholdende 13 (TXNDC13), mens blodpladeaktiverende faktor acetylhydrolase, isoform Ib, beta-underenhed 30 kDa (PAFAH1B2), synovial translokation sarcoma , kromosom 18 (SS18) og peroxisom biogenese faktor 1 (PEX1) var de mest opregulerede. Desuden har Washizuka et al. (2009) viste, at valproat, men ikke lithium, signifikant øgede ekspressionen af ​​genet, der koder for en underenhed af mitokondrielt kompleks I (NDUFV2) i LCL'er fra japanske BD-patienter. Med hensyn til andre psykiatriske fænotyper viser upublicerede data fra LCL'er fra BD-patienter karakteriseret for forskellig risiko for selvmordsadfærd, at in vitro lithiumbehandling signifikant forstyrrede ekspressionen af ​​genet, der koder for det hastighedsbegrænsende enzym spermidin/spermin N(1)-acethyltransferase (SAT1) (Squassina et al., under forberedelse).

Udover genekspressionsundersøgelser er LCL'er også blevet brugt til at undersøge effekten af ​​lithium på proteinniveauer hos BD-personer. Studiet fra Tseng et al. (2008) afslørede, at basale BDNF-proteinniveauer er faldet i LCL'er fra lithium-responsive BD-patienter sammenlignet med både deres upåvirkede slægtninge og med raske kontroldeltagere. Interessant nok reducerede in vitro-behandling med lithium af LCL'erne BDNF-niveauer hos alle deltagere, men forskellen mellem BD-patienter og raske kontroller forblev.

Derudover er den pleiotrope effekt af lithium på gen- og proteinekspression blevet dybt undersøgt i en serie undersøgelser med dyr (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) og humane (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) cellevæv.

Specifikt: 1) Lithium har vist sig at øge ekspressionen af ​​det anti-apoptotiske gen BCL2 med reduktion af ekspressionen af ​​de pro-apoptotiske gener p53 og Bax (Chen et al., 1999), hvilket klart indikerer en rolle i at påvirke den molekylære kaskade regulering af den programmerede celledød. Dette bevis får særlig interesse i lyset af de seneste resultater om BCL2. To nyere undersøgelser (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) viste, at BCL2-genekspression reguleret af enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) rs956572 hos individer med BD direkte påvirkede intracellulær Ca2+-homeostase dysregulering, et mol signalvejen viste sig at spille en væsentlig rolle i patogenesen af ​​BD. 2) Ved at bruge en genom bred genekspressionstilgang (GWGE) på flere humane prostatacancercellelinjer, der blev inkuberet med lithium, viste Sun og kollegaer 11 en markant nedregulering af gener involveret i DNA-replikation. I en anden undersøgelse har Seelan et al. (2008), i forsøget på at profilere den lithiummodulerede genekspression i humane neuronale celler med mikroarray, identificerede peroxiredoxin 2 (PRDX2), et antioxidantenzym, som det mest opregulerede gen, og tribler homolog 3 (TRB3), et pro-apoptotisk middel. protein, som det mest nedregulerede, hvilket yderligere antyder en rolle af disse veje i humørstabiliseringsprocessen.

Sammenfattende har lithium vist sig at signifikant modulere størrelsen af ​​ekspressionen af ​​en række gener, blandt hvilke de mest robuste og replikerede ændringer var for BCL2, BAX, p53 og SAT1. Således kan vi drage fordel af lithiums veletablerede egenskab til at regulere ekspressionen af ​​disse gener og proteiner på en signifikant og stabil måde. Omvendt kunne disse gener bruges som markører for effekten på lithium på genekspressionen, hvilket giver et mål til undersøgelse af effektiviteten af ​​EBV-immortalisering og gentagne passager til at eliminere in vivo behandlingseffekterne.

Forsøgsmål

Dette forslag har til formål at validere antagelsen om, at LCL'er via EBV-immortalisering og gentagne passager ikke er påvirket af miljøforhold, og især lægemiddelbehandling, på prøveudtagningstidspunktet.

For at gøre dette vil der blive udtaget prøver fra friske lymfocytter og LCL'er hos 20 raske frivillige før (T0) og efter (T1) fire ugers lithiumbehandling i en stabil dosis.

Først vil et sæt molekylære undersøgelser i friske lymfocytter undersøge ekspressionsniveauerne i målgener (nemlig BCL2, BAX, p53, SAT1) og protein (BDNF) og aktiviteten af ​​kompleks I (alle biologiske mål, der allerede vides at være op- /ned-reguleret af lithium) ved T0 og T1. Disse biologiske mål vil tjene som en analysefølsomhed. Vi forventer, at de bliver reguleret af in vivo lithiumbehandling og som følge heraf er signifikant forskellige mellem T0 og T1 i friske lymfocytter.

Kun de biologiske mål, der viser signifikant forskel i friske lymfocytter (ikke transformeret med EBV) vil derefter blive analyseret i LCL'er. Differentiel udtryk mellem LCL'er, der er udtaget ved T0 og T1, vil indikere, at EBV-transformationen og gentagne passager ikke eliminerer miljøpåvirkningerne og specifikt effekten af ​​lithiumbehandling ved prøveudtagning.

Endelig, ved at studere raske frivillige, forventer vi at mindske de forstyrrende faktorer, som tilstedeværelsen af ​​sygdomsstatus giver.