Efeitos do Tratamento com Lítio In Vivo nos Níveis de Expressão Gênica em Linhagens de Células Linfoblastóides de Sujeitos Humanos Saudáveis

Fundo

Uma das maiores limitações da pesquisa psiquiátrica é a necessidade de usar métodos indiretos para estudar as funções neuronais. Entre estes, estudos de linfócitos transformados são uma ferramenta inestimável. Os linfoblastos transformados pelo vírus Epstein Barr (EBV) podem ser usados ​​para uma variedade de propósitos, incluindo estudos in vitro de expressão gênica e investigações de respostas celulares ao tratamento farmacológico. Eles podem ser mantidos e cultivados novamente conforme necessário e muitas vezes podem servir como um suprimento de backup de DNA para análises genéticas. Por essas razões, linhagens celulares de linfoblastos (LCLs) têm sido coletadas e utilizadas por diversos grupos de pesquisa, inclusive o nosso.

A maioria dos investigadores trabalha com a suposição implícita de que essas células transformadas representam traços característicos da pessoa e de sua doença. Em outras palavras, presume-se que a transformação celular e as passagens repetidas reduzam o impacto de quaisquer fatores de confusão presentes no momento da coleta de sangue e isolamento de linfócitos. Esses fatores podem incluir, entre outros, o estado clínico, o tratamento real ou a hora do dia. Surpreendentemente, não encontramos nenhum dado publicado que apoie ou contradiga essa suposição.

Aqui nos propomos a investigar os efeitos de um fator particular que pode influenciar várias medidas celulares, nomeadamente o tratamento medicamentoso in vivo. Especificamente, estamos interessados ​​em avaliar o efeito do tratamento com lítio, um íon que possui propriedades estabilizadoras do humor. De fato, o lítio é o tratamento mais eficaz no transtorno bipolar, com aproximadamente 30% dos pacientes atingindo a remissão completa da doença e a prevenção da recorrência do episódio (Baldessarini e Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Justificativa

O lítio tem efeitos regulatórios bem estabelecidos na expressão de genes-alvo específicos. Estudos de expressão gênica em LCLs de pacientes caracterizados por resposta ao tratamento com lítio identificaram uma série de alvos moleculares modulados diretamente por essa droga. Um estudo de microarray (Sun et al., 2004) em LCLs de pacientes com TB caracterizados por resposta completa ao lítio demonstrou seu efeito na diminuição da expressão de sete genes: receptor de somatostatina tipo 2 (SSTR2), fator nuclear kappa-B subunidade de ligação ao DNA (NF-kB), adrenoceptor alfa1B (1B-AR), precursor da cadeia alfa da proteína receptora de acetilcolina (ACHR), fosfodiesterase 4D 3', 5'-cíclica dependente de cAMP (PDE4D), receptor da substância P (SPR) e proteína relacionada com ras (RAB7), sendo as cinco últimas validadas por análise de Northern blotting. Recentemente, usando LCLs de três indivíduos saudáveis, Sugawara e colaboradores (2010) identificaram 44 genes cuja expressão era regulada pelo lítio. Entre os dez genes mais infrarregulados pelo lítio estavam Bax, fator 1 relacionado à zuotina (ZRF1) e domínio tiorredoxina contendo 13 (TXNDC13), enquanto fator ativador de plaquetas acetilhidrolase, isoforma Ib, subunidade beta 30 kDa (PAFAH1B2), translocação do sarcoma sinovial , o cromossomo 18 (SS18) e o fator de biogênese do peroxissoma 1 (PEX1) foram os mais regulados. Além disso, Washizuka et al. (2009) mostraram que o valproato, mas não o lítio, aumentou significativamente a expressão do gene que codifica uma subunidade do complexo mitocondrial I (NDUFV2) em LCLs de pacientes japoneses com TB. Em relação a outros fenótipos psiquiátricos, dados não publicados de LCLs de pacientes com TB caracterizados por diferentes riscos de comportamento suicida estão mostrando que o tratamento in vitro com lítio perturbou significativamente a expressão do gene que codifica a enzima limitante da taxa espermidina/espermina N(1)-acetiltransferase (SAT1) (Squassina et al., em preparação).

Além dos estudos de expressão gênica, os LCLs também têm sido usados ​​para investigar o efeito do lítio nos níveis de proteína em indivíduos com TB. O estudo de Tseng et al. (2008) revelou que os níveis basais de proteína BDNF são diminuídos em LCLs de pacientes com TB responsivos ao lítio quando comparados com seus parentes não afetados e com participantes saudáveis ​​de controle. Curiosamente, o tratamento in vitro com lítio dos LCLs diminuiu os níveis de BDNF em todos os participantes, mas a diferença entre pacientes com TB e controles saudáveis ​​permaneceu.

Além disso, o efeito pleiotrópico do lítio na expressão de genes e proteínas foi profundamente investigado em uma série de estudos em animais (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) e tecidos celulares humanos (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008).

Especificamente: 1) Foi demonstrado que o lítio aumenta a expressão do gene anti-apoptótico BCL2 com redução da expressão dos genes pró-apoptóticos p53 e Bax (Chen et al., 1999) indicando claramente um papel na influência da cascata molecular regulando a morte celular programada. Esta evidência adquire particular interesse à luz das descobertas recentes sobre BCL2. Dois estudos recentes (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) demonstraram que, em indivíduos com TB, a expressão do gene BCL2 regulada pelo polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs956572 afetou diretamente a desregulação da homeostase do Ca2+ intracelular, um A via de sinalização provou desempenhar um papel significativo na patogênese da DB. 2) Usando uma abordagem de expressão gênica ampla do genoma (GWGE) em várias linhagens de células de câncer humano da próstata que foram incubadas com lítio, Sun e colaboradores 11 mostraram uma regulação negativa acentuada dos genes envolvidos na replicação do DNA. Em outro estudo, Seelan et al. (2008), na tentativa de traçar o perfil da expressão gênica modulada pelo lítio em células neuronais humanas com microarray, identificaram a peroxirredoxina 2 (PRDX2), uma enzima antioxidante, como o gene mais regulado positivamente, e o homólogo tribbles 3 (TRB3), um gene pró-apoptótico proteína, como a mais regulada para baixo, sugerindo ainda um papel dessas vias no processo de estabilização do humor.

Em resumo, provou-se que o lítio modula significativamente a magnitude da expressão de vários genes, entre os quais as alterações mais robustas e replicadas foram para BCL2, BAX, p53 e SAT1. Assim, podemos aproveitar a propriedade bem estabelecida do lítio de regular a expressão desses genes e proteínas de maneira significativa e estável. Por outro lado, esses genes poderiam ser usados ​​como marcadores do efeito do lítio na expressão gênica, fornecendo uma medida para a investigação da eficácia da imortalização do EBV e passagens repetidas na eliminação dos efeitos do tratamento in vivo.

Objetivos do teste

Esta proposta visa validar a hipótese de que os LCLs, via imortalização do EBV e passagens repetidas, não são influenciados pelas condições ambientais, e principalmente pelo tratamento medicamentoso, no momento da amostragem.

Para isso, linfócitos frescos e LCLs serão amostrados em 20 voluntários saudáveis ​​antes (T0) e após (T1) quatro semanas de tratamento com lítio em uma dose estável.

Em primeiro lugar, um conjunto de estudos moleculares em linfócitos frescos examinará os níveis de expressão em genes-alvo (nomeadamente BCL2, BAX, p53, SAT1) e proteína (BDNF), e a atividade do Complexo I (todas as medidas biológicas já conhecidas por aumentar /regulado para baixo por lítio) em T0 e T1. Estas medidas biológicas servirão como um ensaio de sensibilidade. Esperamos que eles sejam regulados pelo tratamento com lítio in vivo e, conseqüentemente, sejam significativamente diferentes entre T0 e T1 em linfócitos frescos.

Apenas as medidas biológicas que mostram diferença significativa em linfócitos frescos (não transformados com EBV) serão então analisadas em LCLs. A expressão diferencial entre os LCLs amostrados em T0 e T1 indicará que a transformação EBV e as passagens repetidas não eliminam as influências ambientais e, especificamente, o efeito do tratamento com lítio na amostragem.

Finalmente, ao estudar voluntários saudáveis, esperamos diminuir os fatores de confusão causados ​​pela presença do estado de doença.