In vivo lithiumbehandelingseffecten op genexpressieniveaus in lymfoblastoïde cellijnen van menselijke gezonde proefpersonen

Achtergrond

Een van de belangrijkste beperkingen van psychiatrisch onderzoek is de noodzaak om indirecte methoden te gebruiken om neuronale functies te bestuderen. Onder deze zijn studies van getransformeerde lymfocyten een hulpmiddel van onschatbare waarde. Epstein Barr-virus (EBV) getransformeerde lymfoblasten kunnen voor verschillende doeleinden worden gebruikt, waaronder in vitro studies van genexpressie en onderzoeken van cellulaire reacties op farmacologische behandeling. Ze kunnen worden bewaard en opnieuw worden gekweekt als dat nodig is en kunnen vaak dienen als reservevoorraad voor DNA voor genetische analyses. Om deze redenen zijn lymfoblastcellijnen (LCL's) verzameld en gebruikt door een aantal onderzoeksgroepen, waaronder de onze.

De meeste onderzoekers werken met de impliciete veronderstelling dat dergelijke getransformeerde cellen kenmerken van de persoon en diens ziekte vertegenwoordigen. Met andere woorden, de celtransformatie en herhaalde passages worden verondersteld de impact van eventuele verstorende factoren die aanwezig zijn op het moment van bloedafname en lymfocytenisolatie te verminderen. Deze factoren kunnen onder meer de klinische toestand, de daadwerkelijke behandeling of het tijdstip van de dag zijn. Verrassend genoeg konden we geen gepubliceerde gegevens vinden die deze veronderstelling ondersteunen of tegenspreken.

Hier stellen we voor om de effecten te onderzoeken van een bepaalde factor die verschillende cellulaire maatregelen kan beïnvloeden, namelijk in vivo medicamenteuze behandeling. We zijn met name geïnteresseerd in het beoordelen van het effect van behandeling met lithium, een ion met stemmingsstabiliserende eigenschappen. Lithium is inderdaad de meest effectieve behandeling bij bipolaire stoornis, waarbij ongeveer 30% van de patiënten volledige remissie van de ziekte bereikt en herhaling van episoden voorkomt (Baldessarini en Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

grondgedachte

Lithium heeft gevestigde regulerende effecten op de expressie van specifieke doelgenen. Genexpressiestudies op LCL's van patiënten die werden gekarakteriseerd voor respons op behandeling met lithium hebben een reeks moleculaire doelwitten geïdentificeerd die direct door dit medicijn worden gemoduleerd. Een microarray-onderzoek (Sun et al., 2004) naar LCL's van patiënten met BD die werden gekarakteriseerd voor volledige respons op lithium, toonde het effect ervan aan bij het verminderen van de expressie van zeven genen: somatostatinereceptor type 2 (SSTR2), nucleaire factor kappa-B DNA-bindende subeenheid (NF-kB), alfa1B-adrenoceptor (1B-AR), acetylcholinereceptoreiwit alfaketenprecursor (ACHR), cAMP-afhankelijke 3', 5'-cyclische fosfodiësterase 4D (PDE4D), substantie-P-receptor (SPR), en ras-gerelateerd eiwit (RAB7), waarbij de laatste vijf zijn gevalideerd door middel van Northern-blotting-analyse. Onlangs identificeerden Sugawara en collega's (2010) met behulp van LCL's van drie gezonde proefpersonen 44 genen waarvan de expressie werd gereguleerd door lithium. Onder de tien genen die het meest door lithium werden gereguleerd, waren Bax, zuotin-gerelateerde factor 1 (ZRF1) en thioredoxinedomein met 13 (TXNDC13), terwijl bloedplaatjes-activerende factor acetylhydrolase, isovorm Ib, beta-subeenheid 30 kDa (PAFAH1B2), synoviaal sarcoomtranslocatie , chromosoom 18 (SS18) en peroxisoombiogenese factor 1 (PEX1) waren het meest opwaarts gereguleerd. Bovendien, Washizuka et al. (2009) toonden aan dat valproaat, maar niet lithium, de expressie van het gen dat codeert voor een subeenheid van mitochondriaal complex I (NDUFV2) significant verhoogde in LCL's van Japanse BD-patiënten. Met betrekking tot andere psychiatrische fenotypes, laten niet-gepubliceerde gegevens van LCL's van BD-patiënten die worden gekarakteriseerd voor een verschillend risico op suïcidaal gedrag zien dat in vitro lithiumbehandeling de expressie van het gen dat codeert voor het snelheidsbeperkende enzym spermidine/spermine N(1)-acetyltransferase aanzienlijk verstoort. (SAT1) (Squassina et al., in voorbereiding).

Naast genexpressiestudies zijn LCL's ook gebruikt om het effect van lithium op eiwitniveaus bij BD-patiënten te onderzoeken. De studie van Tseng et al. (2008) onthulden dat basale BDNF-eiwitniveaus verlaagd zijn in LCL's van op lithium reagerende BD-patiënten in vergelijking met zowel hun onaangetaste familieleden als met gezonde controledeelnemers. Interessant genoeg verlaagde in vitro behandeling met lithium van de LCL's de BDNF-waarden bij alle deelnemers, maar het verschil tussen BD-patiënten en gezonde controles bleef bestaan.

Bovendien is het pleiotrope effect van lithium op genexpressie en eiwitexpressie grondig onderzocht in een reeks onderzoeken met dieren (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) en menselijke (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) celweefsels.

Specifiek: 1) Van lithium is aangetoond dat het de expressie van het anti-apoptotische gen BCL2 verhoogt met vermindering van de expressie van de pro-apoptotische genen p53 en Bax (Chen et al., 1999), wat duidelijk wijst op een rol bij het beïnvloeden van de moleculaire cascade reguleren van de geprogrammeerde celdood. Dit bewijs krijgt vooral belangstelling in het licht van recente bevindingen over BCL2. Twee recente onderzoeken (Machado-Vieira et al., 2011; Uemura et al., 2011) toonden aan dat bij personen met BD de BCL2-genexpressie, gereguleerd door het single nucleotide polymorphism (SNP) rs956572, een directe invloed had op intracellulaire Ca2+-homeostase ontregeling, een moleculaire signaalroute bleek een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van BD. 2) Met behulp van een genoombrede genexpressiebenadering (GWGE) op meerdere menselijke prostaatkankercellijnen die werden geïncubeerd met lithium, toonden Sun en collega's 11 een duidelijke neerwaartse regulatie van genen die betrokken zijn bij DNA-replicatie. In een andere studie, Seelan et al. (2008), in een poging om de lithium-gemoduleerde genexpressie in menselijke neuronale cellen met microarray te profileren, identificeerde peroxiredoxine 2 (PRDX2), een antioxidant-enzym, als het meest opgereguleerde gen, en tribbles homolog 3 (TRB3), een pro-apoptotisch eiwit, als het meest gedownreguleerde, suggereert verder een rol van deze routes in het stemmingsstabilisatieproces.

Samenvattend is bewezen dat lithium de omvang van de expressie van een aantal genen aanzienlijk moduleert, waaronder de meest robuuste en gerepliceerde veranderingen voor BCL2, BAX, p53 en SAT1. We kunnen dus profiteren van de gevestigde eigenschap van lithium om de expressie van deze genen en eiwitten op een significante en stabiele manier te reguleren. Omgekeerd zouden deze genen kunnen worden gebruikt als markers van het effect op lithium op de genexpressie, wat een maatstaf is voor het onderzoek naar de effectiviteit van EBV-immortalisatie en herhaalde passages bij het elimineren van de in vivo behandelingseffecten.

Proefdoelstellingen

Dit voorstel heeft tot doel de veronderstelling te valideren dat LCL's, via EBV-immortalisatie en herhaalde passages, niet worden beïnvloed door omgevingsomstandigheden, en met name medicamenteuze behandeling, op het moment van bemonstering.

Hiervoor zullen verse lymfocyten en LCL's worden bemonsterd bij 20 gezonde vrijwilligers vóór (T0) en na (T1) vier weken lithiumbehandeling met een stabiele dosis.

Ten eerste zal een reeks moleculaire studies in verse lymfocyten de expressieniveaus in doelwitgenen (namelijk BCL2, BAX, p53, SAT1) en eiwit (BDNF) en de activiteit van Complex I (alle biologische maatregelen waarvan al bekend is dat ze up-to-date zijn) onderzoeken. /down-gereguleerd door lithium) op T0 en T1. Deze biologische metingen zullen dienen als testgevoeligheid. We verwachten dat ze worden gereguleerd door in vivo lithiumbehandeling en bijgevolg significant verschillen tussen T0 en T1 in verse lymfocyten.

Alleen de biologische metingen die een significant verschil laten zien in verse lymfocyten (niet getransformeerd met EBV) zullen vervolgens worden geanalyseerd in LCL's. Differentiële expressie tussen LCL's bemonsterd op T0 en T1 zal aangeven dat de EBV-transformatie en herhaalde passages de omgevingsinvloeden en met name het effect van lithiumbehandeling bij bemonstering niet elimineren.

Ten slotte verwachten we door het bestuderen van gezonde vrijwilligers de verstorende factoren die worden veroorzaakt door de aanwezigheid van een ziektestatus te verminderen.