Účinky léčby lithiem in vivo na hladiny genové exprese v lymfoblastoidních buněčných liniích od zdravých lidských subjektů

Pozadí

Jedním z hlavních omezení psychiatrického výzkumu je nutnost použití nepřímých metod ke studiu neuronálních funkcí. Mezi nimi jsou neocenitelným nástrojem studie transformovaných lymfocytů. Lymfoblasty transformované virem Epstein Barr (EBV) mohou být použity pro různé účely, včetně in vitro studií genové exprese a zkoumání buněčných odpovědí na farmakologickou léčbu. Lze je uchovávat a podle potřeby znovu pěstovat a často mohou sloužit jako záložní zásoba DNA pro genetické analýzy. Z těchto důvodů byly lymfoblastové buněčné linie (LCL) shromážděny a použity řadou výzkumných skupin, včetně naší vlastní.

Většina vyšetřovatelů pracuje s implicitním předpokladem, že takto transformované buňky reprezentují charakteristické rysy dané osoby a její nemoci. Jinými slovy, předpokládá se, že buněčná transformace a opakované pasáže snižují dopad jakýchkoliv matoucích faktorů přítomných v době odběru krve a izolace lymfocytů. Tyto faktory mohou mimo jiné zahrnovat klinický stav, aktuální léčbu nebo denní dobu. Překvapivě jsme nenašli žádná publikovaná data podporující nebo vyvracející tento předpoklad.

Zde navrhujeme prozkoumat účinky jednoho konkrétního faktoru, který může ovlivnit různá buněčná opatření, a to in vivo medikamentózní léčbu. Konkrétně nás zajímá hodnocení účinku léčby lithiem, iontem, který má vlastnosti stabilizující náladu. Lithium je skutečně nejúčinnější léčbou bipolární poruchy, přičemž přibližně 30 % pacientů dosáhne úplné remise onemocnění a prevence recidivy epizody (Baldessarini a Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Odůvodnění

Lithium má dobře zavedené regulační účinky na expresi specifických cílových genů. Studie genové exprese na LCL od pacientů charakterizovaných odpovědí na léčbu lithiem identifikovaly řadu molekulárních cílů přímo modulovaných tímto lékem. Mikročipová studie (Sun et al., 2004) na LCL pacientů s BD charakterizovaných plnou odpovědí na lithium prokázala jeho účinek na snížení exprese sedmi genů: somatostatinový receptor typu 2 (SSTR2), nukleární faktor kappa-B DNA vazebná podjednotka (NF-kB), alfa1B-adrenoceptor (1B-AR), prekurzor proteinového alfa řetězce acetylcholinového receptoru (ACHR), cAMP-dependentní 3', 5'-cyklická fosfodiesteráza 4D (PDE4D), receptor substance-P (SPR) a ras-příbuzný protein (RAB7), posledních pět je validováno analýzou Northern blotting. Nedávno pomocí LCL od tří zdravých subjektů Sugawara a spolupracovníci (2010) identifikovali 44 genů, jejichž exprese byla regulována lithiem. Mezi deseti geny nejvíce down-regulovanými lithiem byly Bax, faktor 1 související se zuotinem (ZRF1) a doména thioredoxinu obsahující 13 (TXNDC13), zatímco faktor aktivující destičky acetylhydroláza, izoforma Ib, beta podjednotka 30 kDa (PAFAH1B2), translokace synoviálního sarkomu , chromozom 18 (SS18) a faktor biogeneze peroxisomu 1 (PEX1) byly nejvíce up-regulovány. Kromě toho Washizuka a kol. (2009) ukázali, že valproát, ale nikoli lithium, významně zvýšil expresi genu kódujícího podjednotku mitochondriálního komplexu I (NDUFV2) u LCL od japonských pacientů s BD. Pokud jde o další psychiatrické fenotypy, nepublikovaná data od LCL pacientů s BD charakterizovaných pro různé riziko sebevražedného chování ukazují, že léčba lithiem in vitro významně narušila expresi genu kódujícího enzym spermidin/spermin N(1)-acetyltransferázu (SAT1) (Squassina et al., v přípravě).

Kromě studií genové exprese byly LCL také použity ke zkoumání účinku lithia na hladiny proteinů u subjektů s BD. Studie od Tseng et al. (2008) odhalili, že bazální hladiny proteinu BDNF jsou sníženy u LCL u pacientů s BD reagujícími na lithium ve srovnání s jejich nepostiženými příbuznými i se zdravými kontrolními účastníky. Je zajímavé, že in vitro léčba lithiem u LCL snížila hladiny BDNF u všech účastníků, ale rozdíl mezi pacienty s BD a zdravými kontrolami zůstal.

Kromě toho byl pleiotropní účinek lithia na expresi genů a proteinů hluboce zkoumán v řadě studií na zvířatech (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) a lidské (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) buněčné tkáně.

Konkrétně: 1) Bylo prokázáno, že lithium zvyšuje expresi antiapoptotického genu BCL2 se snížením exprese proapoptotických genů p53 a Bax (Chen et al., 1999), což jasně ukazuje na roli při ovlivňování molekulární kaskády regulace programované buněčné smrti. Tento důkaz získává zvláštní zájem ve světle nedávných zjištění o BCL2. Dvě nedávné studie (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) prokázaly, že u jedinců s BD exprese genu BCL2 regulovaná jednonukleotidovým polymorfismem (SNP) rs956572 přímo ovlivnila intracelulární dysregulaci homeostázy Ca2+, molekulární ukázalo se, že signální dráha hraje významnou roli v patogenezi BD. 2) Použití přístupu genomové široké genové exprese (GWGE) na mnohočetných buněčných liniích lidské rakoviny prostaty, které byly inkubovány s lithiem, Sun a spolupracovníci 11 prokázali výraznou downregulaci genů zapojených do replikace DNA. V jiné studii Seelan et al. (2008), ve snaze profilovat lithiem modulovanou genovou expresi v lidských neuronových buňkách pomocí microarray, identifikovali peroxiredoxin 2 (PRDX2), antioxidační enzym, jako nejvíce upregulovaný gen, a tribbles homolog 3 (TRB3), proapoptotický protein, jako nejvíce downregulovaný, což dále naznačuje roli těchto drah v procesu stabilizace nálady.

Stručně řečeno, bylo prokázáno, že lithium významně moduluje velikost exprese řady genů, mezi nimiž byly nejrobustnější a nejreplikovanější změny pro BCL2, BAX, p53 a SAT1. Můžeme tedy využít dobře zavedenou vlastnost lithia regulovat expresi těchto genů a proteinů významným a stabilním způsobem. Naopak, tyto geny by mohly být použity jako markery účinku na lithium na genovou expresi, což poskytuje měřítko pro zkoumání účinnosti imortalizace EBV a opakovaných pasáží při eliminaci účinků léčby in vivo.

Cíle zkoušek

Tento návrh si klade za cíl potvrdit předpoklad, že LCL prostřednictvím imortalizace EBV a opakovaných pasáží nejsou ovlivněny podmínkami prostředí, a zejména léčbou drogami, v době odběru vzorků.

Za tímto účelem se odeberou vzorky čerstvých lymfocytů a LCL u 20 zdravých dobrovolníků před (T0) a po (T1) čtyřtýdenní léčbě lithiem ve stabilní dávce.

Nejprve bude soubor molekulárních studií na čerstvých lymfocytech zkoumat hladiny exprese v cílových genech (jmenovitě BCL2, BAX, p53, SAT1) a proteinu (BDNF) a aktivitu komplexu I (všechna biologická měření, o kterých je již známo, že jsou up- /down-regulovaný lithiem) na T0 a T1. Tato biologická měření budou sloužit jako citlivost testu. Očekáváme, že budou regulovány in vivo ošetřením lithiem a následně se budou významně lišit mezi T0 a T1 v čerstvých lymfocytech.

V LCL pak budou analyzována pouze biologická měření vykazující významný rozdíl v čerstvých lymfocytech (netransformovaných EBV). Rozdílná exprese mezi LCL odebranými v T0 a T1 bude indikovat, že transformace EBV a opakované pasáže neeliminují vlivy prostředí a konkrétně účinek ošetření lithiem při odběru vzorků.

A konečně, studiem zdravých dobrovolníků očekáváme, že snížíme matoucí faktory dané přítomností stavu onemocnění.