인간 건강한 피험자의 림프모세포양 세포주에서 유전자 발현 수준에 대한 생체 내 리튬 치료 효과

배경

정신과 연구의 주요 한계 중 하나는 신경 기능을 연구하기 위해 간접적인 방법을 사용해야 한다는 것입니다. 이 중에서 변형된 림프구에 대한 연구는 매우 귀중한 도구입니다. Epstein Barr 바이러스(EBV) 형질전환 림프모세포는 유전자 발현에 대한 시험관 내 연구 및 약리학적 치료에 대한 세포 반응 조사를 포함하여 다양한 목적으로 사용될 수 있습니다. 그것들은 필요에 따라 유지되고 다시 자랄 수 있으며 종종 유전자 분석을 위한 DNA의 백업 공급 역할을 할 수 있습니다. 이러한 이유로 림프모구 세포주(LCL)가 수집되어 우리 자신을 포함한 여러 연구 그룹에서 사용되었습니다.

대부분의 조사자들은 그러한 형질전환된 세포가 사람과 그들의 질병의 특성 특성을 나타낸다는 암묵적인 가정을 가지고 작업합니다. 즉, 세포 변형 및 반복 계대는 혈액 샘플링 및 림프구 분리 시 존재하는 교란 요인의 영향을 감소시키는 것으로 가정합니다. 이러한 요소에는 무엇보다도 임상 상태, 실제 치료 또는 하루 중 시간이 포함될 수 있습니다. 놀랍게도 이 가정을 뒷받침하거나 반박하는 공개된 데이터를 찾을 수 없었습니다.

여기서 우리는 다양한 세포 측정, 즉 생체 내 약물 치료에 영향을 미칠 수 있는 한 가지 특정 요인의 효과를 조사할 것을 제안합니다. 구체적으로 우리는 기분을 안정시키는 특성을 가진 이온인 리튬 치료 효과를 평가하는 데 관심이 있습니다. 실제로, 리튬은 양극성 장애에서 가장 효과적인 치료법으로 환자의 약 30%가 완전한 질병 완화 및 에피소드 재발 방지를 달성했습니다(Baldessarini and Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

이론적 해석

리튬은 특정 표적 유전자의 발현에 대한 규제 효과가 잘 확립되어 있습니다. 리튬 치료에 대한 반응이 특징인 환자의 LCL에 대한 유전자 발현 연구에서 이 약물에 의해 직접적으로 조절되는 일련의 분자 표적이 확인되었습니다. 리튬에 대한 완전한 반응을 특징으로 하는 BD 환자의 LCL에 대한 마이크로어레이 연구(Sun et al., 2004)는 소마토스타틴 수용체 유형 2(SSTR2), 핵 인자 카파-B DNA 결합 소단위의 7개 유전자의 발현을 감소시키는 효과를 입증했습니다. (NF-kB), 알파1B-아드레노셉터(1B-AR), 아세틸콜린 수용체 단백질 알파 사슬 전구체(ACHR), cAMP 의존성 3', 5'-사이클릭 포스포디에스테라아제 4D(PDE4D), substance-P 수용체(SPR) 및 ras 관련 단백질(RAB7), 후자의 5개 단백질은 노던 블롯팅 분석으로 검증되었습니다. 최근, 3명의 건강한 피험자의 LCL을 사용하여 Sugawara와 동료(2010)는 리튬에 의해 발현이 조절되는 44개의 유전자를 확인했습니다. 리튬에 의해 가장 하향 조절되는 10개의 유전자 중에는 Bax, zuotin related factor 1(ZRF1) 및 13을 포함하는 티오레독신 도메인(TXNDC13)이 있었으며, 혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제, 이소형 Ib, 베타 서브유닛 30kDa(PAFAH1B2), 활막 육종 전위 , 18번 염색체(SS18)와 PEX1(peroxisome biogenesis factor 1)이 가장 많이 상향 조절되었습니다. 또한 Washizuka et al. (2009)은 리튬이 아닌 밸프로에이트가 일본인 BD 환자의 LCL에서 미토콘드리아 복합체 I(NDUFV2)의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 발현을 유의하게 증가시켰음을 보여주었습니다. 다른 정신과적 표현형과 관련하여, 자살 행동의 다른 위험을 특징으로 하는 BD 환자의 LCL의 미공개 데이터는 시험관 내 리튬 치료가 속도 제한 효소 스페르미딘/스페르민 N(1)-아세트산 전이 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 상당히 교란시켰음을 보여주고 있습니다. (SAT1) (Squassina 등, 준비 중).

유전자 발현 연구 외에도 LCL은 리튬이 BD 피험자의 단백질 수준에 미치는 영향을 조사하는 데 사용되었습니다. Tseng 등의 연구. (2008)은 영향을 받지 않은 친척과 건강한 대조군 참가자 모두와 비교할 때 리튬 반응성 BD 환자의 LCL에서 기본 BDNF 단백질 수준이 감소한다는 것을 밝혔습니다. 흥미롭게도, LCL의 리튬을 사용한 체외 치료는 모든 참가자의 BDNF 수준을 감소시켰지만 BD 환자와 건강한 대조군 사이의 차이는 그대로 유지되었습니다.

또한, 리튬이 유전자 및 단백질 발현에 미치는 다발성 효과는 동물을 이용한 일련의 연구에서 심도 있게 조사되었다(Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) 및 인간(Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) 세포 조직.

구체적으로: 1) 리튬은 pro-apoptotic 유전자 p53 및 Bax의 발현 감소와 함께 anti-apoptotic 유전자 BCL2의 발현을 증가시키는 것으로 나타났습니다(Chen et al., 1999). 프로그램된 세포 사멸을 조절합니다. 이 증거는 BCL2에 대한 최근 연구 결과에 비추어 특히 관심을 끌고 있습니다. 2건의 최근 연구(Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011)는 BD 환자에서 단일 염기 다형성(SNP) rs956572에 의해 조절되는 BCL2 유전자 발현이 세포 내 Ca2+ 항상성 조절 장애, 분자 신호 전달 경로는 BD의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다. 2) 리튬과 함께 배양된 다수의 전립선 인간 암 세포주에서 게놈 광역 유전자 발현 접근법(GWGE)을 사용하여, Sun과 동료들은 11 DNA 복제와 관련된 유전자의 현저한 하향 조절을 보여주었습니다. 또 다른 연구에서 Seelan et al. (2008), 마이크로어레이로 인간 신경 세포에서 리튬 조절 유전자 발현을 프로파일링하려는 시도에서 항산화 효소인 peroxiredoxin 2(PRDX2)가 가장 상향 조절된 유전자로 확인되었고 tribbles homolog 3(TRB3), pro apoptotic 단백질은 가장 하향 조절되며 기분 안정화 과정에서 이러한 경로의 역할을 추가로 제안합니다.

요약하면, 리튬은 여러 유전자의 발현 정도를 크게 조절하는 것으로 입증되었으며, 그 중 가장 강력하고 복제된 변화는 BCL2, BAX, p53 및 SAT1에 대한 것이었습니다. 따라서, 우리는 중요하고 안정적인 방식으로 이러한 유전자 및 단백질의 발현을 조절하는 리튬의 잘 확립된 특성을 이용할 수 있습니다. 반대로, 이러한 유전자는 유전자 발현에 대한 리튬에 대한 영향의 마커로 사용될 수 있으며, 생체 내 치료 효과를 제거하는 데 있어서 EBV 불멸화 및 반복 계대의 효과를 조사하기 위한 척도를 제공합니다.

시험 목표

이 제안은 EBV 불멸화 및 반복 계대를 통해 LCL이 샘플링 당시의 환경 조건, 특히 약물 치료의 영향을 받지 않는다는 가정을 검증하는 것을 목표로 합니다.

이를 위해 신선한 림프구와 LCL은 20명의 건강한 지원자에서 안정적인 용량으로 리튬 치료 4주 전(T0)과 후(T1)에 샘플링됩니다.

첫째, 신선한 림프구에 대한 일련의 분자 연구는 표적 유전자(즉, BCL2, BAX, p53, SAT1) 및 단백질(BDNF)의 발현 수준과 Complex I의 활성(이미 알려진 모든 생물학적 측정이 /리튬에 의해 하향 조절됨) T0 및 T1에서. 이러한 생물학적 측정은 분석 감도로 사용됩니다. 우리는 그것들이 생체 내 리튬 처리에 의해 조절되고 결과적으로 신선한 림프구에서 T0과 T1 사이에 유의미한 차이가 있을 것으로 기대합니다.

신선한 림프구(EBV로 형질전환되지 않음)에서 상당한 차이를 보이는 생물학적 측정만이 LCL에서 분석될 것입니다. T0과 T1에서 샘플링된 LCL 간의 차등 표현은 EBV 변환 및 반복된 통과가 환경 영향, 특히 샘플링 시 리튬 처리의 영향을 제거하지 않음을 나타냅니다.

마지막으로, 건강한 지원자를 연구함으로써 질병 상태의 존재로 인한 교란 요인을 줄일 수 있을 것으로 기대합니다.