Efectos del tratamiento con litio in vivo sobre los niveles de expresión génica en líneas celulares linfoblastoides de sujetos humanos sanos

Antecedentes

Una de las principales limitaciones de la investigación psiquiátrica es la necesidad de utilizar métodos indirectos para estudiar las funciones neuronales. Entre estos, los estudios de linfocitos transformados son una herramienta invaluable. Los linfoblastos transformados con el virus de Epstein Barr (EBV) se pueden utilizar para una variedad de propósitos, incluidos los estudios in vitro de la expresión génica y las investigaciones de las respuestas celulares al tratamiento farmacológico. Se pueden conservar y volver a cultivar según sea necesario y, a menudo, pueden servir como suministro de respaldo para el ADN para análisis genéticos. Por estas razones, varios grupos de investigación, incluido el nuestro, han recopilado y utilizado líneas celulares de linfoblastos (LCL).

La mayoría de los investigadores trabajan con la suposición implícita de que tales células transformadas representan rasgos característicos de la persona y su enfermedad. En otras palabras, se supone que la transformación celular y los pases repetidos reducen el impacto de cualquier factor de confusión presente en el momento de la toma de muestras de sangre y el aislamiento de linfocitos. Estos factores pueden incluir, entre otros, el estado clínico, el tratamiento real o la hora del día. Sorprendentemente, no pudimos encontrar ningún dato publicado que apoye o contradiga esta suposición.

Aquí proponemos investigar los efectos de un factor particular que puede influir en varias medidas celulares, a saber, el tratamiento farmacológico in vivo. En concreto, nos interesa evaluar el efecto del tratamiento con litio, un ion que posee propiedades estabilizadoras del estado de ánimo. De hecho, el litio es el tratamiento más eficaz en el trastorno bipolar, con aproximadamente el 30% de los pacientes logrando la remisión completa de la enfermedad y la prevención de la recurrencia del episodio (Baldessarini y Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Razón fundamental

El litio tiene efectos reguladores bien establecidos sobre la expresión de genes diana específicos. Los estudios de expresión génica en LCL de pacientes caracterizados por respuesta al tratamiento con litio han identificado una serie de dianas moleculares directamente moduladas por este fármaco. Un estudio de micromatrices (Sun et al., 2004) en LCL de pacientes con BD caracterizados por una respuesta completa al litio demostró su efecto en la disminución de la expresión de siete genes: receptor de somatostatina tipo 2 (SSTR2), subunidad de unión al ADN del factor nuclear kappa-B (NF-kB), adrenoceptor alfa1B (1B-AR), precursor de la cadena alfa de la proteína receptora de acetilcolina (ACHR), fosfodiesterasa cíclica 4D dependiente de cAMP 3', 5' (PDE4D), receptor de sustancia P (SPR) y proteína relacionada con ras (RAB7), siendo los últimos cinco validados por análisis de transferencia Northern. Recientemente, utilizando LCL de tres sujetos sanos, Sugawara y colaboradores (2010) identificaron 44 genes cuya expresión estaba regulada por litio. Entre los diez genes más regulados a la baja por el litio estaban Bax, factor 1 relacionado con zuotina (ZRF1) y dominio de tiorredoxina que contiene 13 (TXNDC13), mientras que el factor activador de plaquetas acetilhidrolasa, isoforma Ib, subunidad beta 30 kDa (PAFAH1B2), translocación de sarcoma sinovial , el cromosoma 18 (SS18) y el factor de biogénesis de peroxisoma 1 (PEX1) fueron los más regulados. Además, Washizuka et al. (2009) demostraron que el valproato, pero no el litio, aumentó significativamente la expresión del gen que codifica una subunidad del complejo mitocondrial I (NDUFV2) en LCL de pacientes japoneses con BD. Con respecto a otros fenotipos psiquiátricos, datos no publicados de LCL de pacientes con BD caracterizados por diferentes riesgos de comportamiento suicida muestran que el tratamiento con litio in vitro perturbó significativamente la expresión del gen que codifica la enzima limitante de la velocidad espermidina/espermina N(1)-acetiltransferasa (SAT1) (Squassina et al., en preparación).

Además de los estudios de expresión génica, las LCL también se han utilizado para investigar el efecto del litio en los niveles de proteína en sujetos con BD. El estudio de Tseng et al. (2008) revelaron que los niveles basales de proteína BDNF están disminuidos en LCL de pacientes con BD sensibles al litio en comparación con sus parientes no afectados y con participantes de control sanos. Curiosamente, el tratamiento in vitro con litio de las LCL disminuyó los niveles de BDNF en todos los participantes, pero se mantuvo la diferencia entre los pacientes con BD y los controles sanos.

Además, el efecto pleiotrópico del litio sobre la expresión de genes y proteínas se ha investigado profundamente en una serie de estudios con animales (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) y tejidos celulares humanos (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008).

Específicamente: 1) Se ha demostrado que el litio aumenta la expresión del gen antiapoptótico BCL2 con una reducción de la expresión de los genes proapoptóticos p53 y Bax (Chen et al., 1999), lo que indica claramente un papel que influye en la cascada molecular. regulando la muerte celular programada. Esta evidencia adquiere particular interés a la luz de los hallazgos recientes sobre BCL2. Dos estudios recientes (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) demostraron que, en individuos con TB, la expresión del gen BCL2 regulada por el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs956572 impactó directamente en la desregulación de la homeostasis del Ca2+ intracelular, un vía de señalización demostró jugar un papel importante en la patogénesis de BD. 2) Mediante el uso de un enfoque de expresión génica amplia del genoma (GWGE) en múltiples líneas celulares de cáncer de próstata humano que se incubaron con litio, Sun y colaboradores 11 mostraron una marcada regulación a la baja de los genes implicados en la replicación del ADN. En otro estudio, Seelan et al. (2008), en un intento de perfilar la expresión del gen modulado por litio en células neuronales humanas con micromatrices, identificaron a la peroxirredoxina 2 (PRDX2), una enzima antioxidante, como el gen más regulado al alza, y al homólogo de tribbles 3 (TRB3), un proapoptótico. proteína, como la más regulada a la baja, lo que sugiere aún más un papel de estas vías en el proceso de estabilización del estado de ánimo.

En resumen, se ha demostrado que el litio modula significativamente la magnitud de la expresión de varios genes, entre los cuales los cambios más robustos y replicados fueron para BCL2, BAX, p53 y SAT1. Por lo tanto, podemos aprovechar la propiedad bien establecida del litio de regular la expresión de estos genes y proteínas de manera significativa y estable. Por el contrario, estos genes podrían usarse como marcadores del efecto del litio en la expresión génica, proporcionando una medida para la investigación de la eficacia de la inmortalización de EBV y los pasajes repetidos para eliminar los efectos del tratamiento in vivo.

Objetivos del ensayo

Esta propuesta tiene como objetivo validar la suposición de que los LCL, a través de la inmortalización de EBV y los pasajes repetidos, no están influenciados por las condiciones ambientales, y especialmente por el tratamiento farmacológico, en el momento del muestreo.

Para ello, se tomarán muestras de linfocitos y LCL frescos en 20 voluntarios sanos antes (T0) y después (T1) de cuatro semanas de tratamiento con litio a una dosis estable.

En primer lugar, un conjunto de estudios moleculares en linfocitos frescos examinará los niveles de expresión en los genes diana (a saber, BCL2, BAX, p53, SAT1) y la proteína (BDNF), y la actividad del Complejo I (todas las medidas biológicas que ya se sabe que están mejoradas). /regulado a la baja por litio) en T0 y T1. Estas medidas biológicas servirán como sensibilidad del ensayo. Esperamos que estén regulados por el tratamiento con litio in vivo y, en consecuencia, que sean significativamente diferentes entre T0 y T1 en linfocitos frescos.

Solo las medidas biológicas que muestren una diferencia significativa en los linfocitos frescos (no transformados con EBV) se analizarán en LCL. La expresión diferencial entre los LCL muestreados en T0 y T1 indicará que la transformación EBV y los pasajes repetidos no eliminan las influencias ambientales y, específicamente, el efecto del tratamiento con litio en el muestreo.

Finalmente, al estudiar voluntarios sanos, esperamos disminuir los factores de confusión dados por la presencia de un estado de enfermedad.