In vivo -litiumkäsittelyn vaikutukset geenien ilmentymistasoihin terveiden ihmisten lymfoblastoidisolulinjoissa

Tausta

Yksi psykiatrisen tutkimuksen suurimmista rajoituksista on tarve käyttää epäsuoria menetelmiä hermosolujen toimintojen tutkimiseen. Näiden joukossa transformoituneiden lymfosyyttien tutkimukset ovat korvaamaton työkalu. Epstein Barr -viruksella (EBV) transformoituja lymfoblasteja voidaan käyttää useisiin tarkoituksiin, mukaan lukien geeniekspression in vitro -tutkimukset ja soluvasteiden tutkimukset farmakologiselle hoidolle. Ne voidaan säilyttää ja kasvattaa uudelleen tarpeen mukaan, ja ne voivat usein toimia DNA:n varalähteenä geneettisiä analyysejä varten. Näistä syistä useat tutkimusryhmät, mukaan lukien omamme, ovat keränneet ja käyttäneet lymfoblastisolulinjoja (LCL).

Useimmat tutkijat työskentelevät implisiittisellä oletuksella, että tällaiset transformoidut solut edustavat henkilön ja hänen sairautensa ominaispiirteitä. Toisin sanoen solujen transformaation ja toistuvien siirrosten oletetaan vähentävän verinäytteenoton ja lymfosyyttien eristämisen aikana esiintyvien häiritsevien tekijöiden vaikutusta. Näitä tekijöitä voivat olla muun muassa kliininen tila, todellinen hoito tai vuorokaudenaika. Yllättäen emme löytäneet julkaistuja tietoja, jotka tukisivat tai kumosivat tätä olettamusta.

Tässä ehdotamme, että tutkitaan yhden tietyn tekijän vaikutuksia, jotka voivat vaikuttaa erilaisiin solutoimiin, nimittäin in vivo -lääkehoidon. Erityisesti olemme kiinnostuneita arvioimaan hoidon vaikutusta litium-ionilla, jolla on mielialaa stabiloivia ominaisuuksia. Itse asiassa litium on tehokkain hoito kaksisuuntaisessa mielialahäiriössä, sillä noin 30 % potilaista saavuttaa taudin täydellisen remission ja ehkäisee episodien uusiutumista (Baldessarini ja Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Perustelut

Litiumilla on vakiintuneet säätelyvaikutukset spesifisten kohdegeenien ilmentymiseen. Geeniekspressiotutkimukset LCL:illä potilailta, joille on ominaista vaste litiumhoitoon, ovat tunnistaneet sarjan molekyylikohteita, joita tämä lääke moduloi suoraan. Microarray-tutkimus (Sun et al., 2004) BD-potilaiden LCL-soluilla, joille on ominaista täydellinen vaste litiumille, osoitti sen vaikutuksen vähentämään seitsemän geenin ilmentymistä: somatostatiinireseptorityyppi 2 (SSTR2), ydintekijä kappa-B DNA:ta sitova alayksikkö (NF-kB), alfa1B-adrenoseptori (1B-AR), asetyylikoliinireseptoriproteiinin alfaketjun esiaste (ACHR), cAMP-riippuvainen 3'-, 5'-syklinen fosfodiesteraasi 4D (PDE4D), substanssi-P-reseptori (SPR) ja ras-sukuinen proteiini (RAB7), joista viimeksi mainitut viisi on validoitu Northern blot -analyysillä. Sugawara ja työtoverit (2010) tunnistivat äskettäin kolmen terveen henkilön LCL:n avulla 44 geeniä, joiden ilmentymistä sääteli litium. Kymmenen litiumin eniten säätelemän geenin joukossa olivat Bax, zuotiniin liittyvä tekijä 1 (ZRF1) ja tioredoksiinidomeeni, joka sisältää 13:n (TXNDC13), kun taas verihiutaleita aktivoiva tekijä asetyylihydrolaasi, isoformi Ib, beeta-alayksikkö 30 kDa (PAFAH1B2), synoviaalinen sarkooma translokaatio , kromosomi 18 (SS18) ja peroksisomin biogeneesitekijä 1 (PEX1) olivat eniten säädeltyjä. Lisäksi Washizuka et ai. (2009) osoittivat, että valproaatti, mutta ei litium, lisäsi merkittävästi mitokondriaalikompleksi I:n (NDUFV2) alayksikköä koodaavan geenin ilmentymistä japanilaisten BD-potilaiden LCL:issä. Mitä tulee muihin psykiatrisiin fenotyyppeihin, julkaisemattomat tiedot BD-potilaiden LCL:istä, joille on ominaista erilainen itsemurhakäyttäytymisen riski, osoittavat, että in vitro litiumhoito häiritsi merkittävästi nopeutta rajoittavaa spermidiini/spermiini-N(1)-asetyylitransferaasientsyymiä koodaavan geenin ilmentymistä. (SAT1) (Squassina et al., valmisteilla).

Geeniekspressiotutkimusten lisäksi LCL:itä on käytetty myös litiumin vaikutuksen tutkimiseen BD-potilaiden proteiinitasoihin. Tsengin et al. (2008) paljasti, että BDNF-perusproteiinitasot ovat alentuneet litiumiin reagoivien BD-potilaiden LCL:issä verrattuna sekä heidän terveisiin sukulaisiinsa, joilla ei ole tautia. Mielenkiintoista on, että LCL:iden in vitro -käsittely litiumilla alensi BDNF-tasoja kaikissa osallistujissa, mutta ero BD-potilaiden ja terveiden kontrollien välillä säilyi.

Li- 1999) ja ihmisen (Sun et ai., 2007; Seelan et ai., 2008) solukudokset.

Erityisesti: 1) Litiumin on osoitettu lisäävän anti-apoptoottisen geenin BCL2 ilmentymistä vähentämällä pro-apoptoottisten geenien p53 ja Bax ilmentymistä (Chen et ai., 1999), mikä osoittaa selvästi roolin molekyylikaskadiin vaikuttamisessa. säätelee ohjelmoitua solukuolemaa. Tämä todiste saa erityisen kiinnostavan BCL2:sta viimeaikaisten löydösten valossa. Kaksi äskettäistä tutkimusta (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) osoittivat, että yksilöillä, joilla on BD, BCL2-geenin ilmentyminen, jota säätelee yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) rs956572, vaikutti suoraan solunsisäiseen Ca2+ -homeostaasin häiriöihin, molekyyleihin. signalointireitillä osoittautui olevan merkittävä rooli BD:n patogeneesissä. 2) Käyttämällä genominlaajuista geeniekspressio-lähestymistapaa (GWGE) useilla ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoilla, joita inkuboitiin litiumin kanssa, Sun ja työtoverit 11 osoittivat DNA:n replikaatioon osallistuvien geenien huomattavan alenemisen. Toisessa tutkimuksessa Seelan et ai. (2008), yrittäessään profiloida litiumin moduloimaa geenin ilmentymistä ihmisen hermosoluissa mikrosirulla, tunnisti peroksiredoksiini 2:n (PRDX2), antioksidanttientsyymin, eniten säädellyksi geeniksi ja tribbles homolog 3:n (TRB3), pro-apoptoottisen. proteiinia, koska se on eniten säädelty, mikä viittaa edelleen näiden reittien rooliin mielialan stabilointiprosessissa.

Yhteenvetona voidaan todeta, että litiumin on osoitettu moduloivan merkittävästi useiden geenien ilmentymisen suuruutta, joista voimakkaimmat ja replikoituneet muutokset olivat BCL2:lle, BAX:lle, p53:lle ja SAT1:lle. Näin ollen voimme hyödyntää litiumin vakiintunutta ominaisuutta säädellä näiden geenien ja proteiinien ilmentymistä merkittävällä ja vakaalla tavalla. Päinvastoin näitä geenejä voitaisiin käyttää litiumiin kohdistuvan vaikutuksen markkereina geenin ilmentymiseen, mikä tarjoaa mittarin EBV:n immortalisoinnin ja toistuvien siirrosten tehokkuuden tutkimiseksi in vivo -hoitovaikutusten eliminoinnissa.

Kokeilutavoitteet

Tällä ehdotuksella pyritään vahvistamaan olettamus, jonka mukaan ympäristöolosuhteet ja etenkään lääkehoito eivät vaikuta EBV:n immortalisoinnin ja toistuvien siirrosten kautta LCL:iin näytteenottohetkellä.

Tätä varten 20 terveeltä vapaaehtoiselta otetaan näytteitä tuoreista lymfosyyteistä ja LCL:istä ennen (T0) ja sen jälkeen (T1) neljän viikon litiumhoitoa vakaalla annoksella.

Ensinnäkin joukko molekyylitutkimuksia tuoreilla lymfosyyteillä tutkii ilmentymistasoja kohdegeeneissä (eli BCL2, BAX, p53, SAT1) ja proteiinissa (BDNF) sekä kompleksin I aktiivisuutta (kaikkien biologisten mittareiden tiedetään jo nousevan). /alassäädetty litiumilla) T0:ssa ja T1:ssä. Nämä biologiset mittaukset toimivat määrityksen herkkyyteen. Odotamme niiden säätelevän in vivo litiumkäsittelyä ja sen seurauksena olevan merkittävästi erilaisia ​​T0:n ja T1:n välillä tuoreissa lymfosyyteissä.

Vain biologiset mitat, jotka osoittavat merkittävän eron tuoreissa lymfosyyteissä (ei transformoitu EBV:llä), analysoidaan sitten LCL:issä. Differentiaalinen ilmentyminen T0:ssa ja T1:ssä otettujen LCL:ien välillä osoittaa, että EBV-muunnos ja toistuvat siirrokset eivät eliminoi ympäristövaikutuksia ja erityisesti litiumkäsittelyn vaikutusta näytteenotossa.

Lopuksi, tutkimalla terveitä vapaaehtoisia, odotamme vähentävän sairauden esiintymisen aiheuttamia hämmentäviä tekijöitä.