体内锂处理对人类健康受试者淋巴母细胞系基因表达水平的影响

背景

精神病学研究的主要局限之一是必须使用间接方法来研究神经元功能。 其中，转化淋巴细胞的研究是一个非常宝贵的工具。 Epstein Barr 病毒 (EBV) 转化的淋巴母细胞可用于多种目的，包括基因表达的体外研究和细胞对药理治疗反应的研究。 它们可以根据需要保存和重新生长，并且通常可以作为 DNA 的备用供应，用于遗传分析。 由于这些原因，淋巴母细胞系 (LCL) 已被许多研究小组收集和使用，包括我们自己的研究小组。

大多数研究人员都隐含地假设这样的转化细胞代表了人及其疾病的特征。 换句话说，假设细胞转化和重复传代可以减少血液采样和淋巴细胞分离时存在的任何混杂因素的影响。 这些因素可能包括临床状态、实际治疗或一天中的时间等。 令人惊讶的是，我们找不到任何支持或反驳这一假设的公开数据。

在这里，我们建议研究可能影响各种细胞措施的一个特定因素的影响，即体内药物治疗。 具体来说，我们有兴趣评估锂治疗的效果，锂是一种具有情绪稳定特性的离子。 事实上，锂是双相情感障碍最有效的治疗方法，大约 30% 的患者实现了疾病的完全缓解和发作复发的预防（Baldessarini 和 Tondo，2000 年；Garnham 等人，2007 年）。

基本原理

锂对特定靶基因的表达具有良好的调节作用。 对以对锂治疗有反应为特征的患者的 LCL 进行的基因表达研究已经确定了一系列由该药物直接调节的分子靶标。 一项针对以对锂完全反应为特征的 BD 患者 LCL 的微阵列研究（Sun 等人，2004 年）证明了其在降低七个基因表达方面的作用：生长抑素受体 2 型 (SSTR2)、核因子 kappa-B DNA 结合亚基(NF-kB)、α1B-肾上腺素能受体 (1B-AR)、乙酰胆碱受体蛋白α链前体 (ACHR)、cAMP 依赖性 3'、5'-环状磷酸二酯酶 4D (PDE4D)、P 物质受体 (SPR) 和ras 相关蛋白 (RAB7)，后五种已通过 Northern 印迹分析验证。 最近，Sugawara 及其同事 (2010) 使用来自三名健康受试者的 LCL，确定了 44 个表达受锂调节的基因。 在被锂下调最多的十个基因中，Bax、zuotin 相关因子 1 (ZRF1) 和含硫氧还蛋白结构域 13 (TXNDC13)，而血小板活化因子乙酰水解酶、同种型 Ib、β 亚基 30 kDa (PAFAH1B2)、滑膜肉瘤易位、18 号染色体 (SS18) 和过氧化物酶体生物发生因子 1 (PEX1) 上调最多。 此外，Washizuka 等人。 (2009) 表明，丙戊酸盐而非锂显着增加了日本 BD 患者 LCL 中线粒体复合物 I (NDUFV2) 亚基编码基因的表达。 关于其他精神病表型，来自具有不同自杀行为风险特征的 BD 患者 LCL 的未发表数据表明，体外锂治疗显着扰乱了编码限速酶亚精胺/精胺 N(1)-乙酰转移酶的基因的表达(SAT1)（Squassina 等人，准备中）。

除了基因表达研究，LCL 还被用于研究锂对 BD 受试者蛋白质水平的影响。 Tseng 等人的研究。 (2008) 显示，与未受影响的亲属和健康对照参与者相比，锂反应性 BD 患者的 LCL 中基础 BDNF 蛋白水平降低。 有趣的是，LCLs 的锂体外治疗降低了所有参与者的 BDNF 水平，但 BD 患者和健康对照之间的差异仍然存在。

此外，锂对基因和蛋白质表达的多效性已在一系列动物研究中得到深入研究（Bosetti 等人，2002 年；McQuillin 等人，2007 年；Chetcuti 等人，2008 年；Chen 等人， 1999) 和人类 (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) 细胞组织。

具体来说：1) 锂已被证明可以增加抗凋亡基因 BCL2 的表达，同时减少促凋亡基因 p53 和 Bax 的表达（Chen 等人，1999），清楚地表明它在影响分子级联反应中的作用调节程序性细胞死亡。 鉴于最近对 BCL2 的研究结果，这一证据引起了特别的兴趣。 最近的两项研究（Machado-Vieira 等人，2011 年；Uemura 等人，2011 年）表明，在患有 BD 的个体中，受单核苷酸多态性 (SNP) rs956572 调控的 BCL2 基因表达直接影响细胞内 Ca2+ 稳态失调，这是一种分子信号通路被证明在 BD 的发病机制中起重要作用。 2) 使用全基因组基因表达方法 (GWGE) 对多个与锂一起孵育的人类前列腺癌细胞系进行研究，Sun 及其同事 11 显示参与 DNA 复制的基因显着下调。 在另一项研究中，Seelan 等人。 (2008)，在尝试用微阵列分析人类神经元细胞中锂调节的基因表达时，鉴定出抗氧化酶过氧化物酶 2 (PRDX2) 作为最上调的基因，以及 tribbles 同系物 3 (TRB3)，一种促凋亡基因蛋白质，作为最下调的，进一步表明这些途径在情绪稳定过程中的作用。

总之，锂已被证明可以显着调节许多基因的表达量级，其中最强大和重复的变化是 BCL2、BAX、p53 和 SAT1。 因此，我们可以利用锂以显着且稳定的方式调节这些基因和蛋白质表达的公认特性。 相反，这些基因可以用作锂对基因表达影响的标记，为研究 EBV 永生化和重复传代消除体内治疗效果的有效性提供了一种衡量标准。

试验目标

该提案旨在验证 LCL 通过 EBV 永生化和重复传代在采样时不受环境条件，尤其是药物治疗影响的假设。

为此，将对 20 名健康志愿者在稳定剂量的锂治疗之前 (T0) 和之后 (T1) 进行 4 周的新鲜淋巴细胞和 LCL 取样。

首先，对新鲜淋巴细胞进行的一系列分子研究将检查目标基因（即 BCL2、BAX、p53、SAT1）和蛋白质（BDNF）的表达水平，以及复合物 I 的活性（所有已知的生物学指标都在上升） /由锂下调）在 T0 和 T1。 这些生物学措施将用作测定灵敏度。 我们预计它们会受到体内锂处理的调节，因此在新鲜淋巴细胞中的 T0 和 T1 之间存在显着差异。

只有在新鲜淋巴细胞（未用 EBV 转化）中显示出显着差异的生物学指标才会在 LCL 中进行分析。 在 T0 和 T1 采样的 LCL 之间的差异表达将表明 EBV 转换和重复传代不会消除环境影响，特别是采样时锂处理的影响。

最后，通过研究健康的志愿者，我们希望减少因疾病状态而产生的混杂因素。