Effekter av in vivo litiumbehandling på genuttrycksnivåer i lymfoblastoidcellinjer från friska människor

Bakgrund

En av de stora begränsningarna för psykiatrisk forskning är nödvändigheten av att använda indirekta metoder för att studera neuronala funktioner. Bland dessa är studier av transformerade lymfocyter ett ovärderligt verktyg. Epstein Barr-virus (EBV) transformerade lymfoblaster kan användas för en mängd olika ändamål, inklusive in vitro-studier av genuttryck och undersökningar av cellulära svar på farmakologisk behandling. De kan behållas och odlas om efter behov och kan ofta fungera som backup för DNA för genetiska analyser. Av dessa skäl har lymfoblastcellinjer (LCL) samlats in och använts av ett antal forskargrupper, inklusive vår egen.

De flesta utredare arbetar med det implicita antagandet att sådana transformerade celler representerar egenskaper hos personen och deras sjukdom. Med andra ord antas celltransformationen och upprepade passager minska effekten av eventuella förvirrande faktorer som finns vid tidpunkten för blodprovstagning och lymfocytisolering. Dessa faktorer kan bland annat inkludera det kliniska tillståndet, den faktiska behandlingen eller tid på dygnet. Överraskande nog kunde vi inte hitta några publicerade data som stöder eller motsäger detta antagande.

Här föreslår vi att undersöka effekterna av en viss faktor som kan påverka olika cellulära åtgärder, nämligen in vivo läkemedelsbehandling. Specifikt är vi intresserade av att bedöma effekten av behandling med litium, en jon som har stämningsstabiliserande egenskaper. Litium är faktiskt den mest effektiva behandlingen vid bipolär sjukdom, med cirka 30 % av patienterna som uppnår fullständig sjukdomsremission och förhindrar återfall av episoder (Baldessarini och Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Logisk grund

Litium har väl etablerade reglerande effekter på uttrycket av specifika målgener. Genuttrycksstudier på LCL från patienter karakteriserade för svar på litiumbehandling har identifierat en serie molekylära mål som direkt moduleras av detta läkemedel. En mikroarraystudie (Sun et al., 2004) på ​​LCL hos patienter med BD karakteriserade för full respons på litium visade dess effekt på att minska uttrycket av sju gener: somatostatinreceptor typ 2 (SSTR2), nukleär faktor kappa-B DNA-bindande subenhet (NF-kB), alfa1B-adrenoceptor (1B-AR), acetylkolinreceptorprotein-alfakedjeprekursor (ACHR), cAMP-beroende 3', 5'-cykliskt fosfodiesteras 4D (PDE4D), substans-P-receptor (SPR), och ras-relaterat protein (RAB7), varvid de fem senare valideras genom Northern blotting-analys. Nyligen, med hjälp av LCL från tre friska försökspersoner, identifierade Sugawara och medarbetare (2010) 44 gener vars uttryck reglerades av litium. Bland de tio gener som mest nedreglerades av litium var Bax, zuotinrelaterad faktor 1 (ZRF1) och tioredoxindomän innehållande 13 (TXNDC13), medan trombocytaktiverande faktor acetylhydrolas, isoform Ib, betasubenhet 30 kDa (PAFAH1B2), synovial translokationssarkom , kromosom 18 (SS18) och peroxisom biogenes faktor 1 (PEX1) var de mest uppreglerade. Dessutom har Washizuka et al. (2009) visade att valproat, men inte litium, signifikant ökade uttrycket av genen som kodar för en subenhet av mitokondriellt komplex I (NDUFV2) i LCL från japanska BD-patienter. När det gäller andra psykiatriska fenotyper visar opublicerade data från LCL från BD-patienter som kännetecknas av olika risker för suicidalt beteende att in vitro litiumbehandling avsevärt störde uttrycket av genen som kodar för det hastighetsbegränsande enzymet spermidin/spermin N(1)-acetyltransferas (SAT1) (Squassina et al., under förberedelse).

Förutom genuttrycksstudier har LCL också använts för att undersöka effekten av litium på proteinnivåer hos BD-personer. Studien från Tseng et al. (2008) avslöjade att basala BDNF-proteinnivåer är minskade i LCL från litiumresponsiva BD-patienter jämfört med både deras opåverkade släktingar och med friska kontrolldeltagare. In vitro-behandling med litium av LCL minskade intressant nog BDNF-nivåerna hos alla deltagare, men skillnaden mellan BD-patienter och friska kontroller kvarstod.

Dessutom har den pleiotropa effekten av litium på gen- och proteinuttryck undersökts djupt i en serie studier med djur (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) och mänskliga (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) cellvävnader.

Specifikt: 1) Litium har visat sig öka uttrycket av den anti-apoptotiska genen BCL2 med minskning av uttrycket av de pro-apoptotiska generna p53 och Bax (Chen et al., 1999), vilket tydligt indikerar en roll i att påverka den molekylära kaskaden reglerar den programmerade celldöden. Dessa bevis får särskilt intresse i ljuset av de senaste fynden om BCL2. Två färska studier (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) visade att, hos individer med BD, BCL2-genuttryck reglerat av singelnukleotidpolymorfismen (SNP) rs956572 direkt påverkade intracellulär Ca2+ homeostas dysreglering, en molekyl signalvägen visade sig spela en betydande roll i patogenesen av BD. 2) Genom att använda ett genombrett genuttryckssätt (GWGE) på flera humana prostatacancercellinjer som inkuberades med litium, visade Sun och medarbetare 11 en markant nedreglering av gener involverade i DNA-replikation. I en annan studie har Seelan et al. (2008), i försöket att profilera det litiummodulerade genuttrycket i mänskliga neuronala celler med mikroarray, identifierade peroxiredoxin 2 (PRDX2), ett antioxidantenzym, som den mest uppreglerade genen, och tribblar homolog 3 (TRB3), en pro-apoptotisk protein, som det mest nedreglerade, vilket ytterligare antyder en roll för dessa vägar i humörstabiliseringsprocessen.

Sammanfattningsvis har litium visat sig avsevärt modulera storleken på uttrycket av ett antal gener, bland vilka de mest robusta och replikerade förändringarna var för BCL2, BAX, p53 och SAT1. Således kan vi dra fördel av litiums väletablerade egenskap att reglera uttrycket av dessa gener och proteiner på ett signifikant och stabilt sätt. Omvänt skulle dessa gener kunna användas som markörer för effekten på litium på genuttrycket, vilket ger ett mått för undersökning av effektiviteten av EBV-odödliggörande och upprepade passager för att eliminera effekterna av in vivo-behandlingen.

Försöksmål

Detta förslag syftar till att validera antagandet att LCL, via EBV-odödlighet och upprepade passager, inte påverkas av miljöförhållanden, och särskilt läkemedelsbehandling, vid tidpunkten för provtagning.

För att göra det kommer färska lymfocyter och LCL:er att tas från 20 friska frivilliga före (T0) och efter (T1) fyra veckors litiumbehandling vid en stabil dos.

Först kommer en uppsättning molekylära studier i färska lymfocyter att undersöka uttrycksnivåerna i målgener (nämligen BCL2, BAX, p53, SAT1) och protein (BDNF), och aktiviteten av komplex I (alla biologiska mått som redan är kända för att vara upp- /nedregleras av litium) vid T0 och T1. Dessa biologiska mått kommer att fungera som en analyskänslighet. Vi förväntar oss att de ska regleras av litiumbehandling in vivo och följaktligen vara signifikant olika mellan T0 och T1 i färska lymfocyter.

Endast de biologiska mätningarna som visar signifikant skillnad i färska lymfocyter (ej transformerade med EBV) kommer sedan att analyseras i LCL. Skillnadsuttryck mellan LCL: er provtagna vid T0 och T1 kommer att indikera att EBV-transformationen och upprepade passager inte eliminerar miljöpåverkan och, specifikt, effekten av litiumbehandling vid provtagning.

Slutligen, genom att studera friska frivilliga, förväntar vi oss att minska de störande faktorer som ges av förekomsten av sjukdomsstatus.