Влияние лечения литием in vivo на уровни экспрессии генов в лимфобластоидных клеточных линиях здоровых людей

Задний план

Одним из основных ограничений психиатрических исследований является необходимость использования косвенных методов для изучения функций нейронов. Среди них бесценным инструментом являются исследования трансформированных лимфоцитов. Лимфобласты, трансформированные вирусом Эпштейна-Барра (EBV), можно использовать для различных целей, включая исследования экспрессии генов in vitro и исследования клеточных ответов на фармакологическое лечение. Их можно хранить и выращивать повторно по мере необходимости, и они часто могут служить резервным источником ДНК для генетического анализа. По этим причинам клеточные линии лимфобластов (LCL) были собраны и использованы рядом исследовательских групп, включая нашу собственную.

Большинство исследователей исходят из неявного предположения, что такие трансформированные клетки представляют черты характера человека и его болезни. Другими словами, предполагается, что трансформация клеток и повторные пассажи снижают влияние любых искажающих факторов, присутствующих во время забора крови и выделения лимфоцитов. Эти факторы могут включать, среди прочего, клиническое состояние, фактическое лечение или время суток. Удивительно, но мы не смогли найти никаких опубликованных данных, подтверждающих или опровергающих это предположение.

Здесь мы предлагаем исследовать влияние одного конкретного фактора, который может влиять на различные клеточные показатели, а именно медикаментозное лечение in vivo. В частности, нас интересует оценка эффекта лечения литием, ионом, обладающим свойствами стабилизации настроения. Действительно, литий является наиболее эффективным средством лечения биполярного расстройства: примерно у 30% пациентов достигается полная ремиссия заболевания и предотвращается повторение эпизода (Baldessarini and Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Обоснование

Литий обладает хорошо известным регулирующим действием на экспрессию специфических генов-мишеней. Исследования экспрессии генов на LCL пациентов, характеризующихся реакцией на лечение литием, выявили ряд молекулярных мишеней, непосредственно модулируемых этим препаратом. Исследование микрочипов (Sun et al., 2004) на LCL пациентов с BD, характеризующихся полным ответом на литий, продемонстрировало его влияние на снижение экспрессии семи генов: рецептора соматостатина типа 2 (SSTR2), ДНК-связывающей субъединицы ядерного фактора каппа-B. (NF-kB), альфа1B-адренорецептор (1B-AR), предшественник альфа-цепи белка ацетилхолинового рецептора (ACHR), цАМФ-зависимая 3', 5'-циклическая фосфодиэстераза 4D (PDE4D), рецептор вещества P (SPR) и ras-родственный белок (RAB7), последние пять подтверждены Нозерн-блоттингом. Недавно, используя LCL трех здоровых людей, Sugawara et al. (2010) идентифицировали 44 гена, экспрессия которых регулировалась литием. Среди десяти генов, наиболее подавляемых литием, были Bax, родственный зуотину фактор 1 (ZRF1) и тиоредоксиновый домен, содержащий 13 (TXNDC13), в то время как ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов, изоформа Ib, бета-субъединица 30 кДа (PAFAH1B2), транслокация синовиальной саркомы , хромосома 18 (SS18) и фактор биогенеза пероксисом 1 (PEX1) были наиболее активными. Более того, Washizuka et al. (2009) показали, что вальпроат, но не литий, значительно увеличивал экспрессию гена, кодирующего субъединицу митохондриального комплекса I (NDUFV2) в LCL у японских пациентов с BD. Что касается других психических фенотипов, неопубликованные данные LCL пациентов с БАР, характеризующихся разным риском суицидального поведения, показывают, что лечение литием in vitro значительно нарушало экспрессию гена, кодирующего фермент, лимитирующий скорость спермидин/спермин N(1)-ацетилтрансферазу. (SAT1) (Squassina et al., в процессе подготовки).

Помимо исследований экспрессии генов, LCL также использовались для изучения влияния лития на уровни белка у субъектов с БАР. Исследование Tseng et al. (2008) выявили, что базальные уровни белка BDNF снижены в LCL у пациентов с БД, реагирующих на литий, по сравнению как с их здоровыми родственниками, так и со здоровыми участниками контрольной группы. Интересно, что лечение LCL литием in vitro снижало уровни BDNF у всех участников, но разница между пациентами с BD и здоровым контролем сохранялась.

Кроме того, плейотропный эффект лития на экспрессию генов и белков был тщательно изучен в серии исследований на животных (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) и клеточных тканей человека (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008).

В частности: 1) Было показано, что литий увеличивает экспрессию антиапоптотического гена BCL2 при снижении экспрессии проапоптотических генов p53 и Bax (Chen et al., 1999), что ясно указывает на роль во влиянии на молекулярный каскад Регуляция запрограммированной гибели клеток. Это свидетельство приобретает особый интерес в свете недавних открытий BCL2. Два недавних исследования (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) продемонстрировали, что у людей с BD экспрессия гена BCL2, регулируемая однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) rs956572, напрямую влияет на нарушение регуляции внутриклеточного гомеостаза Ca2+, молекулярную сигнальный путь играет существенную роль в патогенезе ББ. 2) Используя метод полногеномной экспрессии генов (GWGE) на нескольких клеточных линиях рака предстательной железы человека, которые инкубировали с литием, Сан и его коллеги 11 показали заметное подавление генов, участвующих в репликации ДНК. В другом исследовании Seelan et al. (2008), в попытке профилировать модулируемую литием экспрессию гена в нейронных клетках человека с помощью микроматрицы, идентифицировали пероксиредоксин 2 (PRDX2), антиоксидантный фермент, как ген с наибольшей активацией, и гомолог трибблов 3 (TRB3), проапоптотический фермент. белок, как наиболее подавленный, что еще раз указывает на роль этих путей в процессе стабилизации настроения.

Таким образом, было доказано, что литий значительно модулирует величину экспрессии ряда генов, среди которых наиболее устойчивые и воспроизводимые изменения были для BCL2, BAX, p53 и SAT1. Таким образом, мы можем воспользоваться хорошо зарекомендовавшим себя свойством лития регулировать экспрессию этих генов и белков значительным и стабильным образом. И наоборот, эти гены можно было бы использовать в качестве маркеров влияния лития на экспрессию генов, обеспечивая меру для исследования эффективности иммортализации EBV и повторных пассажей в устранении эффектов лечения in vivo.

Цели испытания

Это предложение направлено на подтверждение предположения о том, что на LCL посредством иммортализации EBV и повторных пассажей не влияют условия окружающей среды и особенно медикаментозное лечение во время отбора проб.

Для этого у 20 здоровых добровольцев будут взяты образцы свежих лимфоцитов и LCL до (T0) и после (T1) четырехнедельного лечения литием в стабильной дозе.

Во-первых, в ходе ряда молекулярных исследований на свежих лимфоцитах будут изучены уровни экспрессии генов-мишеней (а именно BCL2, BAX, p53, SAT1) и белка (BDNF), а также активность Комплекса I (уже известно, что все биологические показатели повышаются). / понижающая регулировка литием) при Т0 и Т1. Эти биологические меры будут служить в качестве чувствительности анализа. Мы ожидаем, что они будут регулироваться обработкой литием in vivo и, следовательно, будут значительно различаться между T0 и T1 в свежих лимфоцитах.

Только биологические показатели, демонстрирующие значительную разницу в свежих лимфоцитах (не трансформированных EBV), будут затем проанализированы в LCL. Дифференциальное выражение между LCL, отобранными в T0 и T1, будет указывать на то, что трансформация EBV и повторные пассажи не устраняют влияние окружающей среды и, в частности, эффект обработки литием при отборе проб.

Наконец, изучая здоровых добровольцев, мы ожидаем уменьшить смешанные факторы, связанные с наличием статуса болезни.