Auswirkungen der In-vivo-Lithiumbehandlung auf die Genexpressionsniveaus in lymphoblastoiden Zelllinien von gesunden Probanden

Hintergrund

Eine der größten Einschränkungen der psychiatrischen Forschung ist die Notwendigkeit, indirekte Methoden zur Untersuchung neuronaler Funktionen einzusetzen. Unter diesen sind Studien von transformierten Lymphozyten ein unschätzbares Werkzeug. Mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierte Lymphoblasten können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich In-vitro-Untersuchungen der Genexpression und Untersuchungen der zellulären Reaktionen auf eine pharmakologische Behandlung. Sie können bei Bedarf aufbewahrt und nachgezüchtet werden und können oft als Ersatz für DNA für genetische Analysen dienen. Aus diesen Gründen wurden Lymphoblasten-Zelllinien (LCLs) gesammelt und von einer Reihe von Forschungsgruppen, einschließlich unserer eigenen, verwendet.

Die meisten Forscher gehen von der impliziten Annahme aus, dass solche transformierten Zellen Merkmalsmerkmale der Person und ihrer Krankheit darstellen. Mit anderen Worten, es wird angenommen, dass die Zelltransformation und wiederholte Passagen den Einfluss von Störfaktoren reduzieren, die zum Zeitpunkt der Blutentnahme und Lymphozytenisolierung vorhanden sind. Zu diesen Faktoren können unter anderem der klinische Zustand, die tatsächliche Behandlung oder die Tageszeit gehören. Überraschenderweise konnten wir keine veröffentlichten Daten finden, die diese Annahme stützen oder widerlegen.

Hier schlagen wir vor, die Auswirkungen eines bestimmten Faktors zu untersuchen, der verschiedene zelluläre Maßnahmen beeinflussen kann, nämlich die medikamentöse Behandlung in vivo. Insbesondere sind wir daran interessiert, die Wirkung einer Behandlung mit Lithium zu beurteilen, einem Ion, das stimmungsstabilisierende Eigenschaften besitzt. In der Tat ist Lithium die wirksamste Behandlung bei bipolaren Störungen, wobei etwa 30 % der Patienten eine vollständige Krankheitsremission erreichen und ein Wiederauftreten der Episoden verhindern (Baldessarini und Tondo, 2000; Garnham et al., 2007).

Begründung

Lithium hat gut etablierte regulatorische Wirkungen auf die Expression spezifischer Zielgene. Genexpressionsstudien an LCLs von Patienten, die auf eine Behandlung mit Lithium ansprachen, haben eine Reihe von molekularen Zielen identifiziert, die direkt durch dieses Medikament moduliert werden. Eine Microarray-Studie (Sun et al., 2004) an LCLs von Patienten mit BD, die für ein vollständiges Ansprechen auf Lithium gekennzeichnet waren, zeigte seine Wirkung bei der Verringerung der Expression von sieben Genen: Somatostatinrezeptor Typ 2 (SSTR2), Kernfaktor-kappa-B-DNA-Bindungsuntereinheit (NF-kB), alpha1B-Adrenozeptor (1B-AR), Acetylcholinrezeptorprotein-Alphakettenvorläufer (ACHR), cAMP-abhängige 3', 5'-zyklische Phosphodiesterase 4D (PDE4D), Substanz-P-Rezeptor (SPR) und ras-verwandtes Protein (RAB7), wobei die letzten fünf durch Northern-Blotting-Analyse validiert wurden. Kürzlich identifizierten Sugawara und Mitarbeiter (2010) unter Verwendung von LCLs von drei gesunden Probanden 44 Gene, deren Expression durch Lithium reguliert wurde. Zu den zehn am stärksten durch Lithium herunterregulierten Genen gehörten Bax, der zuotinbezogene Faktor 1 (ZRF1) und die Thioredoxin-Domäne mit 13 (TXNDC13), während der plättchenaktivierende Faktor Acetylhydrolase, Isoform Ib, Beta-Untereinheit 30 kDa (PAFAH1B2), Synovialsarkom-Translokation , Chromosom 18 (SS18) und Peroxisom-Biogenesefaktor 1 (PEX1) waren am stärksten hochreguliert. Darüber hinaus beschreiben Washizuka et al. (2009) zeigten, dass Valproat, aber nicht Lithium, die Expression des Gens, das für eine Untereinheit des mitochondrialen Komplexes I (NDUFV2) kodiert, in LCLs von japanischen BD-Patienten signifikant erhöhte. In Bezug auf andere psychiatrische Phänotypen zeigen unveröffentlichte Daten aus LCLs von BD-Patienten, die für ein unterschiedliches Risiko für suizidales Verhalten gekennzeichnet sind, dass die Lithiumbehandlung in vitro die Expression des Gens, das für das geschwindigkeitsbestimmende Enzym Spermidin/Spermin-N(1)-Acethyltransferase kodiert, signifikant störte (SAT1) (Squassina et al., in Vorbereitung).

Neben Genexpressionsstudien wurden LCLs auch verwendet, um die Wirkung von Lithium auf die Proteinspiegel bei BD-Patienten zu untersuchen. Die Studie von Tseng et al. (2008) zeigten, dass die basalen BDNF-Proteinspiegel bei LCLs von auf Lithium ansprechenden BD-Patienten im Vergleich zu ihren nicht betroffenen Verwandten und zu gesunden Kontrollteilnehmern verringert sind. Interessanterweise verringerte die In-vitro-Behandlung mit Lithium der LCLs die BDNF-Spiegel bei allen Teilnehmern, aber der Unterschied zwischen BD-Patienten und gesunden Kontrollen blieb bestehen.

Darüber hinaus wurde die pleiotrope Wirkung von Lithium auf die Gen- und Proteinexpression in einer Reihe von Tierversuchen eingehend untersucht (Bosetti et al., 2002; McQuillin et al., 2007; Chetcuti et al., 2008; Chen et al., 1999) und menschlichen (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008) Zellgeweben.

Insbesondere: 1) Es wurde gezeigt, dass Lithium die Expression des anti-apoptotischen Gens BCL2 erhöht, wobei die Expression der pro-apoptotischen Gene p53 und Bax verringert wird (Chen et al., 1999), was eindeutig auf eine Rolle bei der Beeinflussung der molekularen Kaskade hinweist Regulierung des programmierten Zelltods. Diese Beweise erwecken angesichts der jüngsten Erkenntnisse zu BCL2 besonderes Interesse. Zwei kürzlich durchgeführte Studien (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) zeigten, dass bei Personen mit BD die BCL2-Genexpression, die durch den Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) rs956572 reguliert wird, die intrazelluläre Ca2+-Homöostase-Dysregulation, eine molekulare, direkt beeinflusste Signalweg spielte eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von BD. 2) Unter Verwendung eines genomweiten Genexpressionsansatzes (GWGE) an mehreren menschlichen Prostatakrebszelllinien, die mit Lithium inkubiert wurden, zeigten Sun und Mitarbeiter 11 eine deutliche Herunterregulierung von Genen, die an der DNA-Replikation beteiligt sind. In einer anderen Studie untersuchten Seelan et al. (2008) identifizierten bei dem Versuch, die Lithium-modulierte Genexpression in menschlichen neuronalen Zellen mit Microarray zu profilieren, Peroxiredoxin 2 (PRDX2), ein antioxidatives Enzym, als das am stärksten hochregulierte Gen und Tribbles Homolog 3 (TRB3), ein Pro-Apoptose Protein als am stärksten herunterreguliert, was weiter auf eine Rolle dieser Signalwege im Stimmungsstabilisierungsprozess hindeutet.

Zusammenfassend hat sich gezeigt, dass Lithium das Ausmaß der Expression einer Reihe von Genen signifikant moduliert, unter denen die robustesten und repliziertesten Veränderungen für BCL2, BAX, p53 und SAT1 waren. Somit können wir uns die gut etablierte Eigenschaft von Lithium zunutze machen, die Expression dieser Gene und Proteine ​​signifikant und stabil zu regulieren. Umgekehrt könnten diese Gene als Marker für die Wirkung von Lithium auf die Genexpression verwendet werden, was ein Maß für die Untersuchung der Wirksamkeit von EBV-Immortalisierung und wiederholten Passagen bei der Eliminierung der in vivo-Behandlungseffekte darstellt.

Versuchsziele

Dieser Vorschlag zielt darauf ab, die Annahme zu bestätigen, dass LCLs durch EBV-Immortalisierung und wiederholte Passagen zum Zeitpunkt der Probenahme nicht durch Umweltbedingungen und insbesondere durch medikamentöse Behandlung beeinflusst werden.

Dazu werden bei 20 gesunden Freiwilligen vor (T0) und nach (T1) einer vierwöchigen Lithiumbehandlung mit einer stabilen Dosis frische Lymphozyten und LCLs entnommen.

Zunächst wird eine Reihe von molekularen Studien in frischen Lymphozyten die Expressionsniveaus in Zielgenen (nämlich BCL2, BAX, p53, SAT1) und Protein (BDNF) sowie die Aktivität von Komplex I (alle biologischen Maßnahmen, von denen bereits bekannt ist, dass sie hoch sind) untersuchen. /heruntergeregelt durch Lithium) bei T0 und T1. Diese biologischen Maße dienen als Assay-Empfindlichkeit. Wir erwarten, dass sie durch in vivo-Lithiumbehandlung reguliert werden und folglich zwischen T0 und T1 in frischen Lymphozyten signifikant unterschiedlich sind.

Nur die biologischen Messungen, die einen signifikanten Unterschied in frischen Lymphozyten (nicht mit EBV transformiert) zeigen, werden dann in LCLs analysiert. Der unterschiedliche Ausdruck zwischen LCLs, die bei T0 und T1 entnommen wurden, zeigt an, dass die EBV-Transformation und wiederholte Passagen die Umwelteinflüsse und insbesondere die Wirkung der Lithiumbehandlung bei der Probenahme nicht eliminieren.

Schließlich erwarten wir durch die Untersuchung gesunder Freiwilliger, die Störfaktoren zu verringern, die durch das Vorhandensein eines Krankheitsstatus gegeben sind.