Effets du traitement au lithium in vivo sur les niveaux d'expression génique dans les lignées cellulaires lymphoblastoïdes de sujets humains sains

Arrière plan

L'une des limites majeures de la recherche psychiatrique est la nécessité d'utiliser des méthodes indirectes pour étudier les fonctions neuronales. Parmi celles-ci, les études de lymphocytes transformés sont un outil précieux. Les lymphoblastes transformés par le virus d'Epstein Barr (EBV) peuvent être utilisés à diverses fins, y compris des études in vitro de l'expression génique et des investigations sur les réponses cellulaires au traitement pharmacologique. Ils peuvent être conservés et régénérés au besoin et peuvent souvent servir de réserve d'ADN pour les analyses génétiques. Pour ces raisons, des lignées cellulaires de lymphoblastes (LCL) ont été collectées et utilisées par un certain nombre de groupes de recherche, y compris le nôtre.

La plupart des chercheurs travaillent avec l'hypothèse implicite que ces cellules transformées représentent des traits caractéristiques de la personne et de sa maladie. En d'autres termes, la transformation cellulaire et les passages répétés sont supposés réduire l'impact de tout facteur de confusion présent au moment du prélèvement sanguin et de l'isolement des lymphocytes. Ces facteurs peuvent inclure, entre autres, l'état clinique, le traitement lui-même ou l'heure de la journée. Étonnamment, nous n'avons trouvé aucune donnée publiée soutenant ou contredisant cette hypothèse.

Nous proposons ici d'étudier les effets d'un facteur particulier qui peut influencer diverses mesures cellulaires, à savoir le traitement médicamenteux in vivo. Plus précisément, nous nous intéressons à l'évaluation de l'effet d'un traitement au lithium, un ion qui possède des propriétés stabilisatrices de l'humeur. En effet, le lithium est le traitement le plus efficace dans le trouble bipolaire, avec environ 30 % des patients obtenant une rémission complète de la maladie et la prévention de la récurrence des épisodes (Baldessarini et Tondo, 2000 ; Garnham et al., 2007).

Raisonnement

Le lithium a des effets régulateurs bien établis sur l'expression de gènes cibles spécifiques. Des études d'expression génique sur les LCL de patients caractérisés pour leur réponse au traitement au lithium ont identifié une série de cibles moléculaires directement modulées par ce médicament. Une étude de puces à ADN (Sun et al., 2004) sur les LCL de patients atteints de MB caractérisés pour une réponse complète au lithium a démontré son effet dans la diminution de l'expression de sept gènes : le récepteur de la somatostatine de type 2 (SSTR2), la sous-unité de liaison à l'ADN du facteur nucléaire kappa-B (NF-kB), récepteur alpha1B-adrénergique (1B-AR), précurseur de la chaîne alpha de la protéine du récepteur de l'acétylcholine (ACHR), phosphodiestérase cyclique 3', 5'-dépendante de l'AMPc 4D (PDE4D), récepteur de la substance-P (SPR) et ras-related protein (RAB7), les cinq dernières étant validées par analyse Northern blot. Récemment, en utilisant des LCL de trois sujets sains, Sugawara et ses collaborateurs (2010) ont identifié 44 gènes dont l'expression était régulée par le lithium. Parmi les dix gènes les plus régulés à la baisse par le lithium figuraient Bax, le facteur 1 lié à la zuotine (ZRF1) et le domaine thiorédoxine contenant 13 (TXNDC13), tandis que le facteur d'activation plaquettaire acétylhydrolase, isoforme Ib, sous-unité bêta 30 kDa (PAFAH1B2), translocation du sarcome synovial , le chromosome 18 (SS18) et le facteur 1 de biogenèse des peroxysomes (PEX1) étaient les plus régulés positivement. De plus, Washizuka et al. (2009) ont montré que le valproate, mais pas le lithium, augmentait significativement l'expression du gène codant pour une sous-unité du complexe mitochondrial I (NDUFV2) dans les LCL de patients japonais BD. En ce qui concerne d'autres phénotypes psychiatriques, des données non publiées de LCL de patients BD caractérisés pour différents risques de comportement suicidaire montrent que le traitement in vitro au lithium perturbe de manière significative l'expression du gène codant pour l'enzyme limitant la vitesse spermidine/spermine N(1)-acéthyltransférase (SAT1) (Squassina et al., en préparation).

Outre les études d'expression génique, les LCL ont également été utilisées pour étudier l'effet du lithium sur les niveaux de protéines chez les sujets BD. L'étude de Tseng et al. (2008) ont révélé que les niveaux basaux de protéine BDNF sont diminués dans les LCL des patients BD sensibles au lithium par rapport à la fois à leurs parents non affectés et aux participants témoins en bonne santé. Fait intéressant, le traitement in vitro avec du lithium des LCL a diminué les niveaux de BDNF chez tous les participants, mais la différence entre les patients BD et les témoins sains est restée.

De plus, l'effet pléiotropique du lithium sur l'expression des gènes et des protéines a été étudié en profondeur dans une série d'études utilisant des animaux (Bosetti et al., 2002 ; McQuillin et al., 2007 ; Chetcuti et al., 2008 ; Chen et al., 1999) et humains (Sun et al., 2007; Seelan et al., 2008).

Plus précisément : 1) Il a été démontré que le lithium augmente l'expression du gène anti-apoptotique BCL2 avec une réduction de l'expression des gènes pro-apoptotique p53 et Bax (Chen et al., 1999) indiquant clairement un rôle dans l'influence de la cascade moléculaire régulation de la mort cellulaire programmée. Cette preuve acquiert un intérêt particulier à la lumière des découvertes récentes sur BCL2. Deux études récentes (Machado-Vieira et al., 2011, Uemura et al., 2011) ont démontré que, chez les individus atteints de MB, l'expression du gène BCL2 régulée par le polymorphisme nucléotidique unique (SNP) rs956572 avait un impact direct sur la dérégulation intracellulaire de l'homéostasie du Ca2+, un mécanisme moléculaire voie de signalisation s'est avérée jouer un rôle important dans la pathogenèse de la BD. 2) En utilisant une approche d'expression génique à l'échelle du génome (GWGE) sur plusieurs lignées de cellules cancéreuses humaines de la prostate qui ont été incubées avec du lithium, Sun et ses collègues 11 ont montré une régulation négative marquée des gènes impliqués dans la réplication de l'ADN. Dans une autre étude, Seelan et al. (2008), dans le cadre d'une tentative de profilage de l'expression génique modulée par le lithium dans les cellules neuronales humaines avec un microréseau, ont identifié la peroxirédoxine 2 (PRDX2), une enzyme antioxydante, comme le gène le plus régulé positivement, et l'homologue tribbles 3 (TRB3), un pro-apoptotique protéine, comme la plus régulée à la baisse, suggérant en outre un rôle de ces voies dans le processus de stabilisation de l'humeur.

En résumé, il a été prouvé que le lithium module de manière significative l'ampleur de l'expression d'un certain nombre de gènes, parmi lesquels les changements les plus robustes et les plus répliqués concernent BCL2, BAX, p53 et SAT1. Ainsi, on peut tirer parti de la propriété bien établie du lithium de réguler l'expression de ces gènes, et protéines, de manière significative et stable. Inversement, ces gènes pourraient être utilisés comme marqueurs de l'effet du lithium sur l'expression des gènes, fournissant une mesure pour l'étude de l'efficacité de l'immortalisation de l'EBV et des passages répétés pour éliminer les effets du traitement in vivo.

Objectifs de l'essai

Cette proposition vise à valider l'hypothèse selon laquelle les LCL, via l'immortalisation de l'EBV et les passages répétés, ne sont pas influencés par les conditions environnementales, et notamment le traitement médicamenteux, au moment du prélèvement.

Pour ce faire, des lymphocytes frais et des LCL seront prélevés chez 20 volontaires sains avant (T0) et après (T1) quatre semaines de traitement au lithium à dose stable.

Tout d'abord, un ensemble d'études moléculaires dans des lymphocytes frais examinera les niveaux d'expression dans les gènes cibles (à savoir BCL2, BAX, p53, SAT1) et la protéine (BDNF), et l'activité du complexe I (toutes les mesures biologiques déjà connues pour être /abaissée par le lithium) à T0 et T1. Ces mesures biologiques serviront de sensibilité au dosage. Nous nous attendons à ce qu'ils soient régulés par un traitement au lithium in vivo et par conséquent qu'ils soient significativement différents entre T0 et T1 dans les lymphocytes frais.

Seules les mesures biologiques montrant une différence significative dans les lymphocytes frais (non transformés avec EBV) seront ensuite analysées en LCL. L'expression différentielle entre les LCL prélevés à T0 et T1 indiquera que la transformation EBV et les passages répétés n'éliminent pas les influences environnementales et, en particulier, l'effet du traitement au lithium lors du prélèvement.

Enfin, en étudiant des volontaires sains, nous espérons diminuer les facteurs de confusion donnés par la présence d'un état pathologique.