Wpływ leczenia litem in vivo na poziomy ekspresji genów w liniach komórek limfoblastoidalnych pochodzących od zdrowych osób

Tło

Jednym z głównych ograniczeń badań psychiatrycznych jest konieczność stosowania metod pośrednich do badania funkcji neuronów. Wśród nich nieocenionym narzędziem są badania transformowanych limfocytów. Limfoblasty transformowane wirusem Epsteina-Barra (EBV) można stosować do różnych celów, w tym do badań in vitro ekspresji genów i badań odpowiedzi komórkowych na leczenie farmakologiczne. Można je przechowywać i ponownie hodować w razie potrzeby i często mogą służyć jako zapasowe źródło DNA do analiz genetycznych. Z tych powodów linie komórkowe limfoblastów (LCL) zostały zebrane i wykorzystane przez wiele grup badawczych, w tym naszą własną.

Większość badaczy pracuje z domniemanym założeniem, że takie przekształcone komórki reprezentują cechy charakterystyczne osoby i jej choroby. Innymi słowy, zakłada się, że transformacja komórek i powtarzane pasażowanie zmniejszają wpływ wszelkich czynników zakłócających obecnych w czasie pobierania próbek krwi i izolacji limfocytów. Czynnikami tymi mogą być m.in. stan kliniczny, aktualnie stosowane leczenie czy pora dnia. Co zaskakujące, nie mogliśmy znaleźć żadnych opublikowanych danych potwierdzających lub zaprzeczających temu założeniu.

Tutaj proponujemy zbadać wpływ jednego konkretnego czynnika, który może wpływać na różne środki komórkowe, a mianowicie leczenie farmakologiczne in vivo. W szczególności jesteśmy zainteresowani oceną efektu leczenia litem, jonem o właściwościach stabilizujących nastrój. Rzeczywiście, lit jest najskuteczniejszym sposobem leczenia choroby afektywnej dwubiegunowej, przy czym około 30% pacjentów osiąga całkowitą remisję choroby i zapobiega nawrotom epizodów (Baldessarini i Tondo, 2000; Garnham i in., 2007).

Racjonalne uzasadnienie

Lit ma dobrze ugruntowany wpływ regulacyjny na ekspresję określonych genów docelowych. Badania ekspresji genów na LCL od pacjentów charakteryzujących się odpowiedzią na leczenie litem zidentyfikowały szereg celów molekularnych bezpośrednio modulowanych przez ten lek. Badanie mikromacierzy (Sun i in., 2004) dotyczące LCL pacjentów z ChAD charakteryzujących się pełną odpowiedzią na lit wykazało jego wpływ na zmniejszenie ekspresji siedmiu genów: receptora somatostatyny typu 2 (SSTR2), czynnika jądrowego kappa-B DNA wiążącego podjednostkę (NF-kB), alfa1B-adrenergiczny (1B-AR), prekursor łańcucha alfa białka receptora acetylocholiny (ACHR), zależna od cAMP 3', 5'-cykliczna fosfodiesteraza 4D (PDE4D), receptor substancji-P (SPR) i białko pokrewne ras (RAB7), przy czym ostatnie pięć potwierdzono za pomocą analizy Northern blotting. Ostatnio, używając LCL od trzech zdrowych osób, Sugawara i współpracownicy (2010) zidentyfikowali 44 geny, których ekspresja była regulowana przez lit. Wśród dziesięciu genów najbardziej regulowanych w dół przez lit były Bax, czynnik związany z zuotyną 1 (ZRF1) i domena tioredoksyny zawierająca 13 (TXNDC13), podczas gdy acetylohydrolaza czynnika aktywującego płytki krwi, izoforma Ib, podjednostka beta 30 kDa (PAFAH1B2), translokacja mięsaka błony maziowej , chromosom 18 (SS18) i czynnik biogenezy peroksysomów 1 (PEX1) były najbardziej regulowane w górę. Co więcej, Washizuka i in. (2009) wykazali, że walproinian, ale nie lit, znacząco zwiększał ekspresję genu kodującego podjednostkę kompleksu mitochondrialnego I (NDUFV2) w LCL pochodzących od japońskich pacjentów z ChAD. W odniesieniu do innych fenotypów psychiatrycznych, niepublikowane dane dotyczące LCL pacjentów z ChAD charakteryzujących się różnym ryzykiem zachowań samobójczych wskazują, że leczenie litem in vitro istotnie zaburzało ekspresję genu kodującego enzym ograniczający szybkość N(1)-acetylotransferazy spermidyny/sperminy (SAT1) (Squassina i in., w przygotowaniu).

Oprócz badań nad ekspresją genów, LCL zostały również wykorzystane do zbadania wpływu litu na poziom białka u osób z ChAD. Badanie przeprowadzone przez Tseng i in. (2008) ujawnili, że podstawowe poziomy białka BDNF są obniżone w LCL u pacjentów z BD reagujących na lit w porównaniu zarówno z ich zdrowymi krewnymi, jak i zdrowymi uczestnikami z grupy kontrolnej. Co ciekawe, leczenie litem LCL in vitro zmniejszyło poziomy BDNF u wszystkich uczestników, ale różnica między pacjentami z ChAD a zdrowymi kontrolami pozostała.

Ponadto plejotropowy wpływ litu na ekspresję genów i białek został dokładnie zbadany w serii badań na zwierzętach (Bosetti i in., 2002; McQuillin i in., 2007; Chetcuti i in., 2008; Chen i in., 1999) i ludzkich (Sun i in., 2007; Seelan i in., 2008) tkanek komórkowych.

Konkretnie: 1) Wykazano, że lit zwiększa ekspresję antyapoptotycznego genu BCL2 z redukcją ekspresji proapoptotycznych genów p53 i Bax (Chen i in., 1999), co wyraźnie wskazuje na rolę wpływania na kaskadę molekularną regulujące zaprogramowaną śmierć komórki. Dowody te zyskują szczególne zainteresowanie w świetle ostatnich odkryć dotyczących BCL2. Dwa ostatnie badania (Machado-Vieira i in., 2011, Uemura i in., 2011) wykazały, że u osób z ChAD ekspresja genu BCL2 regulowana przez polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) rs956572 bezpośrednio wpływała na rozregulowanie wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2+, molekularny okazało się, że szlak sygnałowy odgrywa znaczącą rolę w patogenezie ChAD. 2) Stosując metodę ekspresji genów w całym genomie (GWGE) na wielu liniach ludzkich komórek raka prostaty, które inkubowano z litem, Sun i współpracownicy 11 wykazali wyraźne obniżenie poziomu genów zaangażowanych w replikację DNA. W innym badaniu Seelan i in. (2008), próbując profilować modulowaną litem ekspresję genów w ludzkich komórkach nerwowych za pomocą mikromacierzy, zidentyfikowali peroksiredoksynę 2 (PRDX2), enzym przeciwutleniający, jako gen o największej regulacji w górę, oraz tribbles homolog 3 (TRB3), proapoptotyczny białko, jako najbardziej obniżone, co dodatkowo sugeruje rolę tych szlaków w procesie stabilizacji nastroju.

Podsumowując, udowodniono, że lit znacząco moduluje wielkość ekspresji wielu genów, wśród których najbardziej solidne i replikowane zmiany dotyczyły BCL2, BAX, p53 i SAT1. W ten sposób możemy wykorzystać dobrze ugruntowaną właściwość litu do regulowania ekspresji tych genów i białek w znaczący i stabilny sposób. Odwrotnie, geny te można wykorzystać jako markery wpływu litu na ekspresję genów, dostarczając miary do badania skuteczności unieśmiertelniania EBV i powtarzanych pasaży w eliminowaniu skutków leczenia in vivo.

Cele próby

Ta propozycja ma na celu potwierdzenie założenia, że ​​na LCL, poprzez unieśmiertelnienie EBV i powtarzane pasaże, nie mają wpływu warunki środowiskowe, a zwłaszcza leczenie farmakologiczne, w czasie pobierania próbek.

W tym celu pobiera się świeże limfocyty i LCL od 20 zdrowych ochotników przed (T0) i po (T1) czterech tygodniach leczenia litem w stabilnej dawce.

Po pierwsze, zestaw badań molekularnych na świeżych limfocytach zbada poziomy ekspresji w docelowych genach (tj. /w dół regulowany przez lit) w T0 i T1. Te pomiary biologiczne będą służyć jako czułość testu. Oczekujemy, że będą one regulowane przez traktowanie litem in vivo iw konsekwencji będą znacząco różnić się między T0 i T1 w świeżych limfocytach.

Tylko pomiary biologiczne wykazujące znaczącą różnicę w świeżych limfocytach (nietransformowanych EBV) będą następnie analizowane w LCL. Zróżnicowana ekspresja między LCL pobranymi w T0 i T1 wskaże, że transformacja EBV i powtarzane pasaże nie eliminują wpływów środowiskowych, a konkretnie wpływu traktowania litem podczas pobierania próbek.

Wreszcie, badając zdrowych ochotników, spodziewamy się zmniejszenia czynników zakłócających wynikających z obecności stanu chorobowego.