Az in vivo lítiumkezelés hatása a génexpressziós szintekre egészséges emberi alanyokból származó limfoblasztoid sejtvonalakban

Háttér

A pszichiátriai kutatások egyik fő korlátja az, hogy szükség van közvetett módszerek alkalmazására a neuronális funkciók tanulmányozására. Ezek között a transzformált limfociták vizsgálata felbecsülhetetlen értékű eszköz. Az Epstein Barr vírussal (EBV) transzformált limfoblasztok számos célra felhasználhatók, beleértve a génexpresszió in vitro vizsgálatait és a gyógyszeres kezelésre adott sejtválaszok vizsgálatát. Szükség esetén megtarthatók és újratermeszthetők, és gyakran szolgálhatnak tartalék DNS-forrásként a genetikai elemzésekhez. Ezen okok miatt a limfoblaszt sejtvonalakat (LCL) számos kutatócsoport gyűjtötte és használta, köztük a miénk is.

A legtöbb kutató azzal az implicit feltételezéssel dolgozik, hogy az ilyen transzformált sejtek a személy és a betegség jellemzőit képviselik. Más szavakkal, feltételezhető, hogy a sejttranszformáció és az ismételt passzálás csökkenti a vérmintavétel és a limfocita izolálás idején jelen lévő zavaró tényezők hatását. E tényezők közé tartozhat többek között a klinikai állapot, a tényleges kezelés vagy a napszak. Meglepő módon nem találtunk olyan publikált adatot, amely ezt a feltételezést alátámasztotta vagy ellentmondana.

Itt azt javasoljuk, hogy vizsgáljuk meg egy bizonyos tényező hatását, amely befolyásolhatja a különböző sejtszintű intézkedéseket, nevezetesen az in vivo gyógyszeres kezelést. Konkrétan a hangulatstabilizáló tulajdonságokkal rendelkező lítiummal végzett kezelés hatásának felmérése érdekel bennünket. Valójában a lítium a leghatékonyabb kezelés a bipoláris zavarban, a betegek körülbelül 30%-a éri el a betegség teljes remisszióját és megelőzi az epizód kiújulását (Baldessarini és Tondo, 2000; Garnham és mtsai, 2007).

Indoklás

A lítium jól megalapozott szabályozó hatással rendelkezik a specifikus célgének expressziójára. A lítiumkezelésre reagáló betegek LCL-jein végzett génexpressziós vizsgálatok egy sor molekuláris célpontot azonosítottak, amelyet közvetlenül ez a gyógyszer modulál. Egy microarray-vizsgálat (Sun et al., 2004) BD-ben szenvedő betegek LCL-jein, akiknél a lítiumra adott teljes válaszreakciót jellemezték, kimutatta a gén expresszióját csökkentő hatását hét gén: 2-es típusú szomatosztatin receptor (SSTR2), nukleáris faktor kappa-B DNS-kötő alegysége. (NF-kB), alfa1B-adrenoceptor (1B-AR), acetilkolin receptor fehérje alfa lánc prekurzor (ACHR), cAMP-függő 3', 5'-ciklikus foszfodiészteráz 4D (PDE4D), anyag-P receptor (SPR) és ras-kapcsolódó fehérje (RAB7), az utóbbi ötöt Northern blot analízissel igazolták. Nemrég Sugawara és munkatársai (2010) három egészséges alanytól származó LCL-ek felhasználásával 44 gént azonosítottak, amelyek expresszióját lítium szabályozta. A lítium által leginkább csökkentett tíz gén közé tartozik a Bax, a zuotinhoz kapcsolódó 1-es faktor (ZRF1) és a 13-as tioredoxin domén (TXNDC13), míg a vérlemezke-aktiváló faktor acetilhidroláz, Ib izoforma, 30 kDa béta-alegység (PAFAH1B2), synovialis szarkóma transzlokáció , a 18-as kromoszóma (SS18) és a peroxiszóma biogenezis 1-es faktora (PEX1) volt a leginkább szabályozott. Ezenkívül Washizuka és mtsai. (2009) kimutatták, hogy a valproát, de nem a lítium, szignifikánsan növelte a mitokondriális komplex I alegységét (NDUFV2) kódoló gén expresszióját japán BD-betegek LCL-eiben. Más pszichiátriai fenotípusok tekintetében az öngyilkos viselkedés eltérő kockázatával jellemezhető BD-betegek LCL-jeiből származó, nem publikált adatok azt mutatják, hogy az in vitro lítiumkezelés jelentősen megzavarta a spermidin/spermin N(1)-acetiltranszferáz sebességkorlátozó enzimet kódoló gén expresszióját. (SAT1) (Squassina et al., előkészítés alatt).

A génexpressziós vizsgálatok mellett LCL-eket is alkalmaztak a lítium fehérjeszintekre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára BD-ben szenvedő alanyokban. Tseng et al. (2008) kimutatták, hogy a lítiumra reagáló BD-betegek LCL-jeiben az alap BDNF fehérjeszintek csökkennek, összehasonlítva a nem érintett rokonaikkal és az egészséges kontroll résztvevőkkel. Érdekes módon az LCL-ek lítiummal végzett in vitro kezelése csökkentette a BDNF-szintet minden résztvevőben, de a BD-betegek és az egészséges kontrollok közötti különbség megmaradt.

Ezen túlmenően a lítium pleiotróp hatását a gén- és fehérjeexpresszióra behatóan vizsgálták egy sor állatkísérletben (Bosetti et al., 2002; McQuillin és mtsai, 2007; Chetcuti és mtsai, 2008; Chen et al., 1999) és humán (Sun et al., 2007; Seelan és mtsai, 2008) sejtszövetek.

Pontosabban: 1) A lítiumról kimutatták, hogy növeli a BCL2 anti-apoptotikus gén expresszióját a p53 és a Bax pro-apoptotikus gének expressziójának csökkentésével (Chen és mtsai, 1999), ami egyértelműen jelzi a molekuláris kaszkád befolyásolásában játszott szerepet. szabályozza a programozott sejthalált. Ez a bizonyíték különösen érdekes a BCL2-vel kapcsolatos legújabb eredmények fényében. Két közelmúltbeli tanulmány (Machado-Vieira és mtsai, 2011, Uemura és mtsai, 2011) kimutatta, hogy BD-ben szenvedő egyénekben az rs956572 egyetlen nukleotid polimorfizmus (SNP) által szabályozott BCL2 génexpresszió közvetlenül befolyásolta az intracelluláris Ca2+ homeosztázis szabályozási zavarát, ami egy molecularis diszreguláció. jelátviteli út jelentős szerepet játszik a BD patogenezisében. 2) A genom-széles génexpressziós megközelítés (GWGE) alkalmazásával több prosztata humán rákos sejtvonalon, amelyeket lítiummal inkubáltak, Sun és munkatársai 11 a DNS-replikációban részt vevő gének jelentős lelassulását mutatták ki. Egy másik tanulmányban Seelan és mtsai. (2008) az emberi neuronsejtek lítium-modulált génexpressziójának microarray segítségével történő profilozása során a peroxiredoxin 2-t (PRDX2), egy antioxidáns enzimet azonosították, mint a leginkább szabályozott gént, és a tribbles homolog 3-at (TRB3), amely egy pro apoptotikus. fehérje, mint a leginkább alászabályozott, ami tovább utal ezeknek az útvonalaknak a hangulatstabilizáló folyamatban betöltött szerepére.

Összefoglalva, a lítium bizonyítottan szignifikánsan módosítja számos gén expressziójának nagyságát, amelyek közül a legrobusztusabb és replikáltabb változások a BCL2, BAX, p53 és SAT1 esetében voltak. Így kihasználhatjuk a lítium azon jól bevált tulajdonságát, hogy jelentős és stabil módon szabályozza ezen gének és fehérjék expresszióját. Ezzel szemben ezek a gének a lítiumra gyakorolt ​​hatás markereiként használhatók a génexpresszióra, mércét biztosítva az EBV immortalizálása és az ismételt passzálás hatékonyságának vizsgálatához az in vivo kezelési hatások kiküszöbölésében.

A próba céljai

Ennek a javaslatnak az a célja, hogy igazolja azt a feltételezést, hogy az LCL-eket az EBV immortalizálása és ismételt passzálása révén nem befolyásolják a környezeti feltételek, és különösen a gyógyszeres kezelés a mintavétel időpontjában.

Ennek érdekében 20 egészséges önkéntesen friss limfocitákból és LCL-ekből vesznek mintát a stabil dózisú négyhetes lítiumkezelés előtt (T0) és után (T1).

Először is, a friss limfocitákon végzett molekuláris tanulmányok sorozata megvizsgálja a célgének (nevezetesen a BCL2, BAX, p53, SAT1) és a fehérje (BDNF) expressziós szintjét, valamint a Complex I aktivitását (minden biológiai intézkedés, amelyről már ismert, hogy emelkedik). /le- lítium szabályozza) T0-nál és T1-nél. Ezek a biológiai mérések a vizsgálat érzékenységeként szolgálnak. Arra számítunk, hogy in vivo lítiumkezelés szabályozza őket, és ennek következtében szignifikánsan különböznek a T0 és a T1 között friss limfocitákban.

Csak azokat a biológiai méréseket, amelyek szignifikáns különbséget mutatnak a friss (EBV-vel nem transzformált) limfocitákban, elemezzük ezután az LCL-ekben. A T0 és T1 időpontban mintavételezett LCL-ek közötti differenciált expresszió azt jelzi, hogy az EBV transzformáció és az ismételt passzálás nem szünteti meg a környezeti hatásokat, és különösen a lítiumkezelés hatását a mintavételkor.

Végül egészséges önkéntesek vizsgálatával azt várjuk, hogy csökkenjen a betegségi állapot jelenléte okozta zavaró tényezők.