ザンビアの子供におけるロタウイルスワクチン接種が失敗した原因

この研究は、母子保健（MCH）クリニックと抗レトロウイルス療法（ART）クリニック、ザンビア感染症研究センター（CIDRZ）カムワラ研究ユニットが併設されているルサカのカムワラ保健施設で実施される。 カムワラの集水域人口は 10,000 人を超え、毎月約 30 人の新生児が母子保健を受診し、6 ～ 14 週目 (DPT-HiB-Hep) の予防接種率は 95% 以上です。 母子ペアは、MCHへの初回訪問時に、治験クリニックのアシスタントまたはピアカウンセラーから、選択した現地言語でこの治験に関する情報を提供されます。 一般に興味のある人は、より詳細な情報を得るために近くの研究クリニックに招待され、その間にやる気のある母親が募集され、研究看護師による書面によるインフォームドコンセントのプロセスが行われます。 文盲の参加者の場合は、独立した読み書きできる個人がインフォームド・コンセントのプロセスを目撃し、検証します。 研究に招待された人の日付と人数、文書化された拒否の理由に関する情報を示すために、特定のログが維持されます。

上級研究看護師、研究看護師、臨床研究助手は、研究者の監督の下でインフォームドコンセントと登録手順を担当します。 必要に応じて小児科医が直接相談に応じます。

コホートのフォローアップ。 登録された母親は、人口統計および行動に関するアンケート、参加者検索フォームに記入するよう求められ、登録訪問時に瀉血と母乳の機械的搾乳を受けて、（血清および母乳中の）抗ロタウイルス IgG および IgA を測定するように求められます。 乳児は、野生型免疫グロブリンおよび経胎盤免疫グロブリンへのベースライン曝露を確認するためにベースラインの抗ロタウイルスIgAおよびIgG抗体を測定され、その後、ロタウイルスワクチン接種完了の1か月後（約14〜20週目）に2回目の血清IgA測定が行われます。

その後、残りの研究期間中、乳児は四半期ごとに診療所で追跡調査され、下痢がある場合には臨時の診療所を訪れることになる。 訪問のたびに、子供の体重、身長が測定され、皮下体脂肪の皮膚のひだや上腕の中央周囲の周囲を含む身体測定が行われます。 症状のある暫定来院時には、疾患の重症度（ベシカリスケールによる）が評価され、ロタウイルス陽性の場合はロタウイルス抗原と遺伝子型を決定するために便のサンプルが採取されます。 患者はまた、その後 2 週間にわたって記入する下痢日記を持って帰宅します。 重度の胃腸炎を患っている子供が特定された後、コホート内から年齢が一致する対照（最近胃腸炎を起こしていない）がビタミンAと血清亜鉛レベルの測定のために連れてこられます。 胃腸炎の子供は国のガイドラインに従って治療されます（世界保健機関（WHO）の小児疾患の統合管理による）。 紹介が必要な場合は、外来診療所に紹介されるか、深刻な場合には大学教育病院に紹介されます。

学習手順。 同上。

実験方法。

1. ロタウイルス特異的 IgA および IgG の検出は ELISA によって行われます。 ロタウイルス特異的 IgA および IgG の検出は ELISA によって行われます。 簡単に説明すると、手順は次のとおりです。 マイクロプレートのウェル (Nunc Immuno I など) を精製ウイルス抗原調製物とともにインキュベートし、Tween 洗剤を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS-T) で洗浄します。 血清および母乳サンプルを段階的に希釈し（1% ウシ血清アルブミンを含む PBS-T で）、コーティングされたマイクロプレート内で 37℃で 2 時間、次に 4℃で一晩インキュベートします。 次にマイクロプレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒト IgA または IgG ヤギ抗体 (Sigma Immunochemicals) を添加します。 次に反応を H2SO4 で停止させ、光学密度を EIA プレートリーダーで測定します。 すべてのサンプルは、各ウイルス抗原および対照抗原に対して 2 回ずつアッセイされます。 テストウェルは、450 nm での光学密度が陽性であるとみなされました。たとえば、それがそれ自体の対照の光学密度の 2 倍以上である場合です。 特異性は、サンプルの非存在下でインキュベートされたコントロール抗原を含むウェルを含めることによって制御され、感度は、高力価の特定のロタウイルス特異的免疫グロブリンクラスを含むことが知られているサンプルの存在下でインキュベートされたウイルス抗原を含むウェルを含めることによってチェックされます。
2. ロタウイルス抗原の検出は、ロタクロン ELISA によって行われます。 便サンプルは、メーカーの仕様書に従って、ELISA (Rotaclone®、Meridian Biosciences) によってロタウイルスについて検査されます。 簡単に説明すると、サンプルを室温に戻し、0.02% チメロソールを含む緩衝生理食塩水で希釈します。 次に、希釈したサンプルと酵素複合体を、Rotaclone マイクロプレート内で VP6 タンパク質に対するモノクローナル抗体とともにインキュベートします。 次に、過酸化尿素とテトラメチルベンジジンを含む基質緩衝液を加え、H2SO4 で反応を停止させます。 次に、エアブランクに対して 450 nm での吸光度を測定することにより、結果を分光測光的に決定します。 吸光度単位 (A450) が 0.150 を超える検体は陽性とみなされます。 吸光度が 0.150 以下のものは陰性とみなされます。

3 ロタウイルス VP7 遺伝子型の決定。 ウイルスＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌＴＭ試薬（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中のロタウイルス抗原陽性糞便物質の１０％懸濁液から抽出される。 次に、前述のように、RT-PCR によってウイルス RNA が取得されます。

抽出されたウイルス RNA は、ウイルスタンパク質 7 (VP7) をコードする遺伝子セグメント 9 内の両方のウイルス RNA 鎖の 3' 末端に相補的なプライマーを利用するネステッド PCR によって取得されます。 これらのプライマーはファーストストランド合成に使用されます。 プライマー RVG9 および 6 つの血清型特異的プライマー (aBT1、aCT2、aET3、aDT4、aAT8、および aFT9)。これらは遺伝子 9 上の 6 つの可変領域に位置し、G 血清型 1、2、3、4、8、および 9 に対応します。 、2番目の増幅で使用されます。 簡単に説明すると、25 pmol の各プライマー Beg9 および End9 を含む 5 μl の RNA を 97℃で 5 分間変性し、氷上で冷却します。 その後、1.5μlの10×PCR緩衝液（500mM KCl、100mM Tris-HCl（pH8.3）、2μlの25mM MgCl2、2μlの2.5mMの各dATP、dCTP、dGTPおよび2μlを含むRT反応混合物8μl）を加えた。 dTTP、10 U AMV 逆転写酵素 (Promega) および 20 U Rnasin リボヌクレアーゼ阻害剤 (Promega) をサンプルとプライマーの混合物に添加し、42℃で 60 分間インキュベートします。 3.5μlの10X PCRバッファー、2μlの2.5mMピーチdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、2.5U AmpliTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）および27μlの水を含むPCRバッファー混合物（35μl）をRT反応に添加します。 反応混合物を94℃で3分間変性し、その後30サイクル(94℃で1分、42℃で2分、72℃で3分)、最後に72℃で5分間延長します。 。

第 1 ラウンドの PCR 産物 (2 μl) を、5 μl の 10X PCR バッファー、25 pmol の各プライマー aBT1、aCT2、aET3、aDT4、aAT8、aFT9 および RVG9、各 0.2 mM の dATP を含む 48 μl の第 2 PCR 反応混合物に移します。 、dGTP、dCTPおよびdTTP、2mM MgCl2、2.5UのTaqポリメラーゼ。 第 2 ラウンドのサイクリング条件は、25 サイクルのみが実行されることを除いて、第 1 ラウンドと同じです。 PCR産物はゲル電気泳動によって分析され、増幅されたVP7の予想される長さが特定され、遺伝子型の決定が可能になります。 他のプライマーセット、PCR 条件、および/またはシーケンスは、最初のプライマーが失敗した場合に遺伝子型を識別するために使用されます。

4 VP4 遺伝子型の決定。 遺伝子 4 の PCR タイピングの戦略は、原則として、VP7.64 に使用される戦略と同じです。第 1 鎖合成 (逆転写) では、プライマー Con2 および Con3 (ボックス 3) を利用して、VP4 の高度に保存された領域を利用します。遺伝子セグメント 4 内の両方のウイルス RNA 鎖の 3' 末端。1 ～ 5 μL のウイルス RNA を、3.5 μL のジメチルスルホキシド (Sigma) を含む最終容量 8.5 μL の 0.5 ml 微量遠心管に加え、サンプルを混合し、 97℃で5分間変性させます。 次に、サンプルを氷上で 5 分間冷却し、簡単な遠心分離によって収集します。 13.5 μLのH2O、16 μLのデオキシヌクレオシド三リン酸（各1.25 mM dATP、dGTP、dCTP、およびdTTP）、5 μLの1OXバッファー（100 mM トリス塩酸塩[pH 8.3]、500 mM KCl）（Perkin-Elmer Cetus）、次に、3.5 μL の 25 mM MgCl2、2 μL のプライマー (25 μM の各プライマー、Con 2 および Con 3 を含む)、および 9 U 逆転写酵素を各変性 dsRNA サンプル チューブに添加します (最終反応量は 49 μl になります)。 ) 42℃で 60 分間インキュベートしました。

Taq ポリメラーゼ 1 μL (1.9U) とミネラルオイル 100 μL を加えた後、1 ラウンド目の PCR を 30 サイクル実行します (94℃で 1 分、50℃で 2 分、72℃で 2 分)。 冷却サイクルを使用して、実験終了時にサンプルを 170℃ に保ちます。 第 2 ラウンドのタイピング反応は、第 1 ラウンドの生成物 0.5 ～ 5 μL (生成物が確認できない場合は 5 μL、生成物が確認できる場合は 0.5 μL) を使用して実行する場合、反応混合物 45 μL と混合して最終容量 50 μL とします。 5 μL 未満の最初のラウンドの生成物を追加する場合、50 μL を完成させるための残りの量は、10 mM TrisHCl (pH 8.3) ～ 2.5 mM です。 MgCl2. 反応混合物は、水 19.5 μL、dNTP 16 μL、10X Buffer II 5 μL、25 mM MgCl2 3 μL、プライマーカクテル 1 μL (Con3、1T-1、2T-1、3T-1、および 4T-1)、および 0.5 μL (2.5U) Taq。 サンプルはミネラルオイルで覆われ、25 ラウンドの PCR (最初のラウンドと同じサイクル) を通して採取されます。 次に、サンプルをゲル電気泳動で分析し、生成物のサイズから VP4 遺伝子型を決定できます。 他のプライマーセットおよび/またはシーケンスは、最初のプライマーが失敗した場合に遺伝子型を区別するために使用されます。

5 ビタミン A および亜鉛レベルの測定: 血清サンプルは、メーカーの指示に従って ELISA (例: ヒトビタミン A、EIAAB) によってビタミン A レベルについて評価されます。 簡単に説明すると、このキットで提供されるマイクロタイター プレートは、ビタミン A に特異的な抗体であらかじめコーティングされています。その後、VA およびホースラディッシュに結合したアビジンに特異的なビオチン結合ポリクローナル抗体調製物を含む標準物質またはサンプルを、適切なマイクロタイター プレートのウェルに添加します。ペルオキシダーゼ (HRP) を各マイクロプレートのウェルに添加し、インキュベートします。 次に、テトラメチルベンジジン基質溶液を各ウェルに添加します。 ビタミン A、ビオチン結合抗体、酵素結合アビジンを含むウェルのみが色の変化を示します。 酵素-基質反応は H2SO4 の添加によって停止され、色の変化は 450 nm の波長で分光光度的に測定されます。 次に、サンプル中の VA の濃度は、OD と VA を比較することによって決定されます。サンプルの標準曲線に対する。

亜鉛レベルは、色原体 4-(2-ピリジルアゾ) レゾルシノール ナトリウム塩を用いた分光測光法を使用して血清亜鉛濃度を測定するランプニャーニの単純比色法などのアッセイを使用して血液から測定されます。