Cause del fallimento del vaccino contro il rotavirus nei bambini dello Zambia

Lo studio sarà condotto presso la struttura sanitaria di Kamwala a Lusaka, dove si trovano le cliniche per la salute materna infantile (MCH) e la terapia antiretrovirale (ART) e il Centro per la ricerca sulle malattie infettive dello Zambia (CIDRZ) Kamwala Research Unit. Kamwala ha un bacino di utenza di oltre 10.000 con circa 30 nuovi neonati che si presentano a MCH ogni mese con tassi di immunizzazione di 6-14 settimane (DPT-HiB-Hep) superiori al 95%. Le coppie madre-bambino verranno contattate durante la visita iniziale a MCH dall'assistente della clinica dello studio o dal consulente alla pari con informazioni su questo studio nella lingua locale prescelta. Le persone generalmente interessate saranno invitate alla clinica di ricerca che si trova nelle vicinanze, per informazioni più dettagliate durante le quali le madri motivate saranno reclutate e accompagnate attraverso il processo di consenso informato scritto dall'infermiere dello studio. Per i partecipanti analfabeti, un individuo indipendente e alfabetizzato testimonierà e convaliderà il processo di consenso informato. Verrà mantenuto un registro specifico per mostrare informazioni su date e numeri di quelli invitati allo studio, motivi del rifiuto documentati.

Un'infermiera ricercatrice senior, un'infermiera dello studio e un assistente alla ricerca clinica saranno responsabili del consenso informato e delle procedure di iscrizione sotto la supervisione dello sperimentatore. Un pediatra sarà disponibile per un consulto pratico quando necessario.

Seguito di coorte. Alle madri iscritte verrà chiesto di compilare questionari demografici e comportamentali, un modulo di localizzazione dei partecipanti e di sottoporsi a flebotomia ed espressione meccanica del latte materno alla visita di iscrizione per la determinazione delle IgG e IgA anti-rotavirus (nel siero e nel latte materno). I neonati avranno una determinazione degli anticorpi IgA e IgG anti-rotavirus al basale per accertare l'esposizione al basale all'immunoglobulina wild-type e transplacentare seguita da una seconda determinazione delle IgA sieriche un mese dopo il completamento della vaccinazione contro il rotavirus (a circa 14-20 settimane).

I neonati saranno quindi seguiti trimestralmente in clinica per il resto dello studio e effettueranno anche visite cliniche intermedie se il bambino ha la diarrea. Ad ogni visita, il bambino verrà pesato, misurato in altezza e preso l'antropometria, inclusa la piega cutanea per il grasso corporeo sottocutaneo e la circonferenza della parte superiore del braccio. Durante eventuali visite intermedie sintomatiche, verrà effettuata la valutazione della gravità della malattia (mediante la scala Vesikari) e verrà raccolto un campione di feci per la determinazione dell'antigene e del genotipo del rotavirus se il rotavirus è positivo. Il paziente verrà inoltre rimandato a casa con un diario della diarrea da completare nelle due settimane successive. Dopo l'identificazione di un bambino con gastroenterite grave, verrà introdotto un controllo di pari età all'interno della coorte (senza gastroenterite recente) per la misurazione dei livelli di vitamina A e zinco sierico. I bambini con gastroenterite saranno trattati secondo le linee guida nazionali (per Gestione integrata delle malattie infantili dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS). Se è necessario il rinvio, il bambino verrà indirizzato all'ambulatorio o, nei casi più gravi, al Policlinico universitario.

Procedure di studio. Come sopra.

Metodi di laboratorio.

1. La rilevazione di IgA e IgG specifiche per Rotavirus avverrà mediante ELISA. Il rilevamento di IgA e IgG specifiche per rotavirus avverrà mediante ELISA. In breve, la procedura è la seguente. I pozzetti della micropiastra (ad es. Nunc Immuno I) vengono incubati con preparati di antigeni virali purificati, quindi lavati con soluzione salina tamponata con fosfato con detergente Tween (PBS-T). I campioni di siero e di latte materno vengono diluiti in serie (in PBS-T contenente l'1% di albumina di siero bovino) e incubati nelle micropiastre rivestite per 2 ore a 37°C, quindi per tutta la notte a 4°C. Le micropiastre vengono quindi lavate e vengono aggiunti anticorpi di capra anti-IgA umana o IgG coniugati con perossidasi (Sigma Immunochemicals). La reazione viene quindi terminata con H2SO4 e la densità ottica viene misurata dal lettore di piastre EIA. Tutti i campioni vengono analizzati in duplicato contro ciascun antigene virale e contro un antigene di controllo. Un pozzetto di test è stato considerato positivo dalla sua densità ottica a 450 nm, ad esempio, se è maggiore o uguale a due volte quella del proprio controllo. La specificità viene controllata includendo pozzetti contenenti antigene di controllo incubati in assenza del campione e la sensibilità viene controllata includendo pozzetti contenenti antigene virale incubati in presenza di campioni noti per contenere titoli elevati di una particolare classe di immunoglobuline specifiche per rotavirus.
2. Il rilevamento dell'antigene del Rotavirus avverrà mediante Rotaclone ELISA. I campioni di feci saranno testati per rotavirus mediante ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) secondo le specifiche del produttore. In breve, il campione sarà portato a temperatura ambiente e diluito con soluzione salina tamponata con 0.02% thimerosol. Il campione diluito e il coniugato enzimatico vengono quindi incubati con un anticorpo monoclonale contro la proteina VP6 all'interno della micropiastra Rotaclone. Vengono quindi aggiunti tamponi di substrato contenenti perossido di urea e tetrametilbenzidina e la reazione viene terminata con H2SO4. La determinazione spettrofotometrica del risultato viene quindi effettuata misurando l'assorbanza a 450 nm rispetto a un bianco d'aria. I campioni con unità di assorbanza (A450) superiori a 0,150 sono considerati positivi. Quelli con assorbanza uguale o inferiore a 0,150 sono considerati negativi.

3 Determinazione del genotipo Rotavirus VP7. L'RNA virale viene estratto da una sospensione al 10% di materiale fecale positivo all'antigene del rotavirus in PBS (pH 7,0) utilizzando il reagente TRIzolTM (GIBCO Life Technologies) secondo il protocollo del produttore. L'RNA virale viene quindi prelevato tramite RT-PCR come descritto in precedenza.

L'RNA virale estratto viene quindi prelevato mediante PCR nidificata utilizzando primer complementari alle estremità 3' di entrambi i filamenti di RNA virale all'interno del segmento genico 9, che codifica per la proteina virale 7 (VP7). Questi primer sono usati per la sintesi del primo filamento. Primer RVG9 ​​e sei primer sierotipo-specifici (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 e aFT9) che si trovano in sei regioni variabili sul gene 9 e corrispondono ai sierotipi G 1, 2, 3, 4, 8 e 9 , sono usati nella seconda amplificazione. In breve, 5 µl di RNA con 25 pmol di ogni primer Beg9 e End9 vengono denaturati per 5 min a 97°C e raffreddati su ghiaccio. Successivamente, 8 µl di miscela di reazione RT contenente 1,5 µl di tampone PCR 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl di 25 mM MgCl2, 2 µl di 2,5 mM di ogni dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 10 U AMV trascrittasi inversa (Promega) e 20 U Rnasin ribonucleasi inibitore (Promega), viene aggiunto alla miscela campione-primer e incubato a 42°C per 60 min. Miscela tampone PCR (35 µl), contenente 3,5 µl di tampone PCR 10X, 2 µl di dATP, dCTP, dGTP e dTTP pesca 2,5 mM, 2,5 U AmpliTaq DNA polimerasi (Perkin Elmer) e 27 µl di acqua vengono aggiunti alla reazione RT. La miscela di reazione viene denaturata a 94°C per 3 min, seguiti da 30 cicli (1 min a 94°C, 2 min a 42°C, 3 min a 72°C) e un'estensione finale di 5 min a 72°C .

I prodotti PCR del primo ciclo (2 µl) vengono trasferiti in 48 µl della seconda miscela di reazione PCR, contenente 5 µl di tampone PCR 10X, 25 pmol ciascuno dei primer aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 e RVG9, 0,2 mM ciascuno dATP , dGTP, dCTP e dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U di Taq polimerasi. Le condizioni di ciclismo del secondo round sono identiche al primo round, tranne per il fatto che vengono eseguiti solo 25 cicli. I prodotti della PCR vengono analizzati mediante elettroforesi su gel per identificare le lunghezze previste di VP7 amplificato, consentendo la determinazione del genotipo. Altri set di primer, condizioni PCR e/o sequenziamento vengono utilizzati per distinguere il genotipo quando/se i primer iniziali falliscono.

4 Determinazione del genotipo VP4. La strategia per la tipizzazione PCR del gene 4 è identica, in linea di principio, a quella utilizzata per VP7.64 La sintesi del primo filamento (trascrizione inversa) sfrutta le aree altamente conservate di VP4 utilizzando i primer Con2 e Con3 (Riquadro 3), che sono complementari a le estremità 3' di entrambi i filamenti di RNA virale all'interno del segmento genico 4. Da 1 a 5 µL di RNA virale vengono aggiunti a provette per microcentrifuga da 0,5 ml contenenti 3,5 µl di dimetilsolfossido (Sigma) in un volume finale di 8,5 µl, quindi i campioni vengono miscelati e denaturato a 97°C per 5 min. I campioni vengono quindi raffreddati in ghiaccio per 5 minuti e raccolti mediante breve centrifugazione. 13,5 µL di H20, 16 µL di deossinucleosidi trifosfati (1,25 mM ciascuno dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 5 µL di tampone 1OX (100 mM Tris-cloridrato [pH 8,3], 500 mM KCl) (Perkin-Elmer Cetus), 3,5 µl di MgCl2 25 mM, 2 µl di primer (contenente 25 µM di ogni primer, Con 2 e Con 3) e trascrittasi inversa 9 U vengono quindi aggiunti a ciascuna provetta campione di dsRNA denaturato (per ottenere un volume di reazione finale di 49 µ1 ) e incubato a 42°C per 60 minuti.

Dopo l'aggiunta di 1 µL (1,9U) di Taq polimerasi e 100 µL di olio minerale, viene eseguita la prima PCR per 30 cicli (1 min a 94°C, 2 min a 50°C e 2 min a 72°C. Un ciclo di raffreddamento viene utilizzato per portare i campioni a 17OC al termine dell'esperimento. La reazione di tipizzazione del secondo round, se eseguita utilizzando da 0,5 a 5 µL del prodotto del primo round (5 µL se nessun prodotto visibile; 0,5 µL se prodotto visibile) viene miscelata con 45 µL di miscela di reazione in un volume finale di 50 µL. Se vengono aggiunti meno di 5 µL del primo prodotto rotondo, il volume rimanente, per completare 50 µL, è 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM MgCl-2. La miscela di reazione è 19,5 µL di acqua, 16 µL dNTPs, 5 µL 10X Buffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL del cocktail di primer (contenente 20 µM ciascuno di Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, e 4T-1) e 0,5 µL (2,5U) Taq. I campioni vengono ricoperti con olio minerale e sottoposti a 25 cicli di PCR (stessi cicli del primo ciclo). I campioni vengono quindi analizzati mediante elettroforesi su gel e la dimensione del prodotto consente la determinazione del genotipo VP4. Altri set di primer e/o sequenziamento vengono utilizzati per distinguere il genotipo quando/se i primer iniziali falliscono.

5 Determinazione dei livelli di vitamina A e zinco: i campioni di siero saranno valutati per il livello di vitamina A mediante ELISA (ad esempio, vitamina A umana, EIAAB) secondo le istruzioni del produttore. In breve, la piastra per microtitolazione fornita in questo kit è stata pre-rivestita con un anticorpo specifico per la vitamina A. Gli standard o i campioni vengono quindi aggiunti ai pozzetti appropriati della piastra per microtitolazione con una preparazione di anticorpi policlonali coniugati con biotina specifici per VA e avidina coniugata con rafano La perossidasi (HRP) viene aggiunta a ciascun pozzetto della micropiastra e incubata. Quindi una soluzione di substrato di tetrametilbenzidina viene aggiunta a ciascun pozzetto. Solo i pozzetti che contengono vitamina A, anticorpi coniugati con biotina e avidina coniugata con enzima mostreranno un cambiamento di colore. La reazione enzima-substrato viene interrotta mediante l'aggiunta di un H2SO4 e il cambiamento di colore viene misurato spettrofotometricamente a una lunghezza d'onda di 450 nm. La concentrazione di VA nei campioni viene quindi determinata confrontando la D.O. dei campioni alla curva standard.

I livelli di zinco saranno misurati nel sangue utilizzando saggi come il semplice metodo colorimetrico di Lampugnani che utilizza un metodo spettrofotometrico con cromogeno 4-(2-piridilazo) resorcinolo sale sodico per misurare le concentrazioni sieriche di zinco.