Causas da falha da vacina contra rotavírus em crianças da Zâmbia

O estudo será realizado na unidade de saúde de Kamwala em Lusaka, onde estão localizadas as clínicas de Saúde Materno-Infantil (MCH) e terapia antirretroviral (ART), bem como a Unidade de Pesquisa de Kamwala do Centro de Pesquisa de Doenças Infecciosas da Zâmbia (CIDRZ). Kamwala tem uma população de captação de mais de 10.000 com aproximadamente 30 novos bebês apresentando-se ao MCH a cada mês com taxas de imunização de 6-14 semanas (DPT-HiB-Hep) acima de 95%. Os pares mãe-bebê serão abordados durante a visita inicial ao MCH pelo assistente clínico do estudo ou conselheiro de pares com informações sobre este estudo no idioma local de sua escolha. Os interessados ​​em geral serão convidados para a clínica de pesquisa que fica próxima, para informações mais detalhadas durante as quais as mães motivadas serão recrutadas e levadas através do processo de consentimento informado por escrito pela enfermeira do estudo. Para participantes analfabetos, um indivíduo independente e alfabetizado testemunhará e validará o processo de consentimento informado. Um registro específico será mantido para mostrar informações sobre datas e números de pessoas convidadas para o estudo, motivos de recusa documentados.

Uma enfermeira de pesquisa sênior, enfermeira do estudo e assistente de pesquisa clínica serão responsáveis ​​pelo consentimento informado e pelos procedimentos de inscrição sob a supervisão do investigador. Um pediatra estará disponível para consulta prática quando necessário.

Acompanhamento de Coorte. As mães inscritas serão solicitadas a preencher questionários demográficos e comportamentais, um formulário localizador de participantes e submeter-se a flebotomia e expressão mecânica do leite materno na visita de inscrição para determinação de IgG e IgA anti-rotavírus (no soro e no leite materno). Os bebês terão anticorpos IgA e IgG anti-rotavírus de linha de base determinados para determinar a exposição de linha de base a imunoglobulina de tipo selvagem e transplacentária, seguida por uma segunda determinação de IgA sérica um mês após a conclusão da vacinação contra rotavírus (aproximadamente 14-20 semanas).

Os bebês serão então acompanhados trimestralmente na clínica durante o restante do estudo e também farão visitas clínicas intermediárias se a criança tiver diarreia. Em cada visita, a criança será pesada, medida a altura e medidas antropométricas, incluindo dobra cutânea para gordura corporal subcutânea e circunferência do braço. Durante quaisquer visitas interinas sintomáticas, serão feitas avaliações da gravidade da doença (pela escala de Vesikari) e uma amostra de fezes será coletada para determinação do antígeno e genótipo do rotavírus, se o rotavírus for positivo. O paciente também será enviado para casa com um diário de diarréia a ser preenchido nas duas semanas seguintes. Após a identificação de uma criança com gastroenterite grave, um controle de mesma idade da coorte (sem gastroenterite recente) será trazido para medição dos níveis de vitamina A e zinco sérico. As crianças com gastroenterite serão tratadas de acordo com as diretrizes nacionais (de acordo com o Tratamento Integrado de Doenças da Infância da Organização Mundial da Saúde (OMS). Se houver necessidade de encaminhamento, a criança será encaminhada para ambulatório ou, em casos graves, para o Hospital Universitário.

Procedimentos de estudo. O mesmo que acima.

Métodos de Laboratório.

1. A detecção de IgA e IgG específicos para rotavírus ocorrerá por ELISA. A detecção de IgA e IgG específicas para rotavírus ocorrerá por ELISA. Resumidamente, o procedimento é o seguinte. Os poços da microplaca (por exemplo, Nunc Immuno I) são incubados com preparações de antígeno viral purificado, depois lavados com solução salina tamponada com fosfato com detergente Tween (PBS-T). As amostras de soro e leite materno são diluídas em série (em PBS-T contendo 1% de albumina de soro bovino) e incubadas nas microplacas revestidas por 2 horas a 37oC e depois durante a noite a 4oC. As microplacas são então lavadas e são adicionados anticorpos de cabra anti-IgA ou IgG humanos conjugados com peroxidase (Sigma Immunochemicals). A reação é então terminada com H2SO4, e a densidade óptica é medida pelo leitor de placas EIA. Todas as amostras são testadas em duplicata contra cada antígeno viral e contra um antígeno de controle. Um poço teste foi considerado positivo por sua densidade óptica em 450 nm, por exemplo, se for maior ou igual a duas vezes a do seu próprio controle. A especificidade é controlada pela inclusão de poços contendo antígeno de controle incubado na ausência da amostra, e a sensibilidade é verificada pela inclusão de poços contendo antígeno viral incubado na presença de amostras conhecidas por conterem títulos elevados de uma determinada classe de imunoglobulina específica para rotavírus.
2. A detecção do antígeno do rotavírus ocorrerá por Rotaclone ELISA. As amostras de fezes serão testadas para rotavírus por ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) de acordo com as especificações do fabricante. Resumidamente, a amostra será trazida à temperatura ambiente e diluída com solução salina tamponada com 0,02% de timerosol. A amostra diluída e o conjugado enzimático são então incubados com um anticorpo monoclonal para a proteína VP6 dentro da microplaca Rotaclone. Tampões de substrato contendo peróxido de ureia e tetrametilbenzidina são então adicionados e a reação é terminada com H2SO4. A determinação espectrofotométrica do resultado é então feita medindo a absorbância a 450 nm contra um branco de ar. Amostras com unidades de absorbância (A450) maiores que 0,150 são consideradas positivas. Aqueles com absorbância igual ou inferior a 0,150 são considerados negativos.

3 Determinação do genótipo Rotavirus VP7. O RNA viral é extraído de uma suspensão de 10% de material fecal positivo para antígeno de rotavírus em PBS (pH 7,0) usando o reagente TRIzolTM (GIBCO Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA viral é então levado através de RT-PCR como descrito anteriormente.

O RNA viral extraído é então levado através de nested PCR utilizando primers que são complementares às extremidades 3' de ambas as cadeias de RNA viral dentro do segmento gênico 9, que codifica a proteína viral 7 (VP7). Esses primers são usados ​​para a síntese da primeira fita. Primer RVG9 ​​e seis primers específicos de sorotipo (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 e aFT9) que estão localizados em seis regiões variáveis ​​no gene 9 e correspondem aos sorotipos G 1, 2, 3, 4, 8 e 9 , são usados ​​na segunda amplificação. Resumidamente, 5 µl de RNA com 25 pmol de cada primer Beg9 e End9 são desnaturados por 5 min a 97°C e resfriados em gelo. Em seguida, 8 µl de mistura de reação RT contendo 1,5 µl de tampão de PCR 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl de 25 mM MgCl2, 2 µl de 2,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 10 U AMV transcriptase reversa (Promega) e 20 U Rnasin ribonuclease inibidor (Promega), é adicionado à mistura amostra-iniciador e incubado a 42°C por 60 min. Mistura tampão de PCR (35 µl), contendo 3,5 µl de tampão PCR 10X, 2 µl de 2,5 mM pêssego dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA polimerase (Perkin Elmer) e 27 µl de água são adicionados à reação RT. A mistura reacional é desnaturada a 94°C por 3 min, seguido de 30 ciclos (1 min a 94°C, 2 min a 42°C, 3 min a 72°C) e uma extensão final de 5 min a 72°C .

Os produtos de PCR da primeira rodada (2 µl) são transferidos para 48 µl da segunda mistura de reação de PCR, contendo 5 µl de tampão de PCR 10X, 25 pmol cada primers aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 e RVG9, 0,2 mM cada dATP , dGTP, dCTP e dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U de Taq polimerase. As condições de ciclagem da segunda rodada são idênticas às da primeira rodada, exceto que apenas 25 ciclos são executados. Os produtos de PCR são analisados ​​por eletroforese em gel para identificar comprimentos esperados de VP7 amplificado, permitindo a determinação do genótipo. Outros conjuntos de primers, condições de PCR e/ou sequenciamento são usados ​​para distinguir o genótipo quando/se os primers iniciais falharem.

4 Determinação do Genótipo VP4. A estratégia de tipagem por PCR do gene 4 é idêntica, em princípio, àquela usada para VP7.64 A síntese da primeira fita (transcrição reversa) aproveita áreas altamente conservadas de VP4 utilizando primers Con2 e Con3 (Caixa 3), que são complementares a as extremidades 3' de ambas as fitas de RNA viral dentro do segmento gênico 4. 1 a 5 µL de RNA viral são adicionados a tubos de microcentrífuga de 0,5 ml contendo 3,5 µl de dimetilsulfóxido (Sigma) em um volume final de 8,5 µl, e as amostras são misturadas e desnaturado a 97°C por 5 min. As amostras são então resfriadas em gelo por 5 min e coletadas por breve centrifugação. 13,5 µL de H20, 16 µL de trifosfatos de desoxinucleosídeos (1,25 mM cada dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 5 µL de tampão 1OX (100 mM Tris-cloridrato [pH 8,3], 500 mM KCl) (Perkin-Elmer Cetus), 3,5 µL de MgCl2 25 mM, 2 µl de primer (contendo 25 µM de cada primer, Con 2 e Con 3) e 9 U de transcriptase reversa são então adicionados a cada tubo de amostra de dsRNA desnaturado (para dar um volume de reação final de 49 µ1 ) e incubados a 42oC por 60 minutos.

Após a adição de 1 µL (1,9U) de Taq polimerase e 100 µL de óleo mineral, a PCR de primeira rodada é realizada por 30 ciclos (1 min 94oC, 2 min a 50oC e 2 min a 72oC. Um ciclo de resfriamento é usado para trazer as amostras para 17OC na conclusão do experimento. A reação de tipagem da segunda rodada, se realizada usando 0,5 a 5 µL do produto da primeira rodada (5 µL se nenhum produto visível; 0,5 µL se produto visível) é misturada com 45 µL da mistura de reação em um volume final de 50 µL. Se menos de 5 µL do produto da primeira rodada for adicionado, o volume restante, para completar 50 µL, é 10mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5mM MgCl¬2. A mistura de reação é 19,5 µL de água, 16 µL dNTPs, 5 µL 10X Buffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL do coquetel de primer (contendo 20 µM cada de Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, e 4T-1) e 0,5 µL (2,5U) Taq. As amostras são cobertas com óleo mineral e submetidas a 25 rodadas de PCR (mesmos ciclos da primeira rodada). As amostras são então analisadas por eletroforese em gel e o tamanho do produto permite a determinação do genótipo VP4. Outros conjuntos de primers e/ou sequenciamento são usados ​​para distinguir o genótipo quando/se os primers iniciais falharem.

5 Determinação dos níveis de vitamina A e zinco: As amostras de soro serão avaliadas quanto ao nível de vitamina A por ELISA (por exemplo, vitamina A humana, EIAAB) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, a placa de microtitulação fornecida neste kit foi pré-revestida com um anticorpo específico para a vitamina A. Padrões ou amostras são então adicionados aos poços da placa de microtitulação apropriados com uma preparação de anticorpo policlonal conjugado com biotina específico para VA e Avidina conjugada com Rábano A peroxidase (HRP) é adicionada a cada poço da microplaca e incubada. Em seguida, uma solução de substrato de tetrametilbenzidina é adicionada a cada poço. Apenas os poços que contêm Vitamina A, anticorpo conjugado com biotina e Avidina conjugada com enzima exibirão uma mudança de cor. A reação enzima-substrato é terminada pela adição de H2SO4 e a mudança de cor é medida espectrofotometricamente em um comprimento de onda de 450 nm. A concentração de VA nas amostras é então determinada comparando o O.D. das amostras para a curva padrão.

Os níveis de zinco serão medidos a partir do sangue usando ensaios como o método colorimétrico simples de Lampugnani, que usa um método espectrofotométrico com sal sódico do cromogênio 4-(2-piridilazo) resorcinol para medir as concentrações séricas de zinco.