Причины неудачного применения ротавирусной вакцины у детей Замбии

Исследование будет проводиться в медицинском учреждении Kamwala в Лусаке, где расположены клиники охраны здоровья матери и ребенка (MCH) и антиретровирусной терапии (ART), а также исследовательское подразделение Kamwala Центра исследований инфекционных заболеваний Замбии (CIDRZ). В Камвале насчитывается более 10 000 человек, при этом примерно 30 новых младенцев поступают к врачу каждый месяц с 6-14-недельным уровнем иммунизации (АКДС-HiB-геп) выше 95%. К парам мать-младенец во время первого визита в MCH будет обращаться ассистент исследовательской клиники или равный консультант с информацией об этом исследовании на местном языке по выбору. Те, кто в целом заинтересован, будут приглашены в исследовательскую клинику, которая находится поблизости, для получения более подробной информации, во время которой мотивированные матери будут набраны и пройдены через процесс получения письменного информированного согласия медсестрой-исследователем. Для неграмотных участников независимый, грамотный человек будет свидетелем и подтвердит процесс информированного согласия. Будет вестись специальный журнал для отображения информации о датах и ​​количестве приглашенных на исследование, а также задокументированных причин отказа.

Старшая медсестра-исследователь, медсестра-исследователь и ассистент клинического исследователя будут нести ответственность за информированное согласие и процедуры регистрации под наблюдением исследователя. Педиатр будет доступен для практических консультаций, когда это необходимо.

Когортное наблюдение. Зарегистрированных матерей попросят заполнить демографические и поведенческие анкеты, форму для поиска участников, а также пройти флеботомию и механическое сцеживание грудного молока во время регистрации для определения антиротавирусных IgG и IgA (в сыворотке и грудном молоке). У младенцев будут определять исходные антитела IgA и IgG к ротавирусу для подтверждения исходного воздействия иммуноглобулина дикого типа и трансплацентарного иммуноглобулина с последующим повторным определением IgA в сыворотке через месяц после завершения вакцинации против ротавируса (примерно в 14–20 недель).

Затем младенцы будут наблюдаться ежеквартально в клинике до конца исследования, а также будут совершать промежуточные визиты в клинику, если у ребенка будет диарея. При каждом посещении ребенка будут взвешивать, измерять рост и измерять антропометрические показатели, включая кожную складку для выявления подкожного жира и окружность середины плеча. Во время любых промежуточных посещений с симптомами будет проводиться оценка тяжести заболевания (по шкале Весикари) и будет взят образец стула для определения ротавирусного антигена и генотипа, если ротавирус положительный. Пациент также будет отправлен домой с дневником диареи, который необходимо заполнить в течение следующих двух недель. После выявления ребенка с тяжелым гастроэнтеритом для измерения уровня витамина А и цинка в сыворотке будет привлечен контрольный ребенок того же возраста из когорты (без недавно перенесенного гастроэнтерита). Детей с гастроэнтеритом будут лечить в соответствии с национальными рекомендациями (по комплексному ведению болезней детского возраста Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)). Если требуется направление, ребенка направят в амбулаторную клинику или, в серьезных случаях, в университетскую учебную больницу.

Процедуры исследования. То же, что и выше.

Лабораторные методы.

1. Обнаружение специфичных к ротавирусу IgA и IgG будет происходить с помощью ELISA. Обнаружение специфичных к ротавирусу IgA и IgG будет происходить с помощью ELISA. Вкратце процедура выглядит следующим образом. Лунки микропланшета (например, Nunc Immuno I) инкубируют с очищенными препаратами вирусного антигена, затем промывают фосфатно-солевым буфером с детергентом Tween (PBS-T). Образцы сыворотки и грудного молока последовательно разводят (в PBS-T, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина) и инкубируют в микропланшетах с покрытием в течение 2 часов при 37°C, а затем в течение ночи при 4°C. Затем микропланшеты промывают и добавляют конъюгированные с пероксидазой антитела против человеческого IgA или козьего IgG (Sigma Immunochemicals). Затем реакцию останавливают с помощью H2SO4 и измеряют оптическую плотность с помощью планшет-ридера EIA. Все образцы анализируют в двух повторах против каждого вирусного антигена и против контрольного антигена. Тестовая лунка считалась положительной по ее оптической плотности при 450 нм, например, если она в два раза больше или равна контрольной. Специфичность контролируют включением лунок, содержащих контрольный антиген, инкубированный в отсутствие образца, а чувствительность проверяют включением лунок, содержащих вирусный антиген, инкубированный в присутствии образцов, о которых известно, что они содержат высокий титр определенного ротавирус-специфического класса иммуноглобулинов.
2. Обнаружение антигена ротавируса будет происходить с помощью Rotaclone ELISA. Образцы стула будут проверены на наличие ротавируса с помощью ИФА (Rotaclone®, Meridian Biosciences) в соответствии со спецификациями производителя. Вкратце, образец доводят до комнатной температуры и разбавляют забуференным физиологическим раствором с 0,02% тимерозолом. Разбавленный образец и ферментный конъюгат затем инкубируют с моноклональным антителом к ​​белку VP6 в микропланшете Rotaclone. Затем добавляют субстратные буферы, содержащие перекись мочевины и тетраметилбензидин, и реакцию останавливают с помощью H2SO4. Затем проводят спектрофотометрическое определение результата путем измерения оптической плотности при 450 нм на воздушном бланке. Образцы с единицами поглощения (А450) выше 0,150 считаются положительными. Те, у которых поглощение равно или ниже 0,150, считаются отрицательными.

3 Определение генотипа ротавируса VP7. Вирусную РНК экстрагируют из 10% суспензии ротавирусного антиген-позитивного фекального материала в PBS (pH 7,0) с использованием реагента TRIzolTM (GIBCO Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. Затем вирусную РНК берут с помощью ОТ-ПЦР, как описано ранее.

Затем выделенную вирусную РНК подвергают вложенной ПЦР с использованием праймеров, комплементарных 3'-концам обеих цепей вирусной РНК в сегменте гена 9, который кодирует вирусный белок 7 (VP7). Эти праймеры используются для синтеза первой цепи. Праймер RVG9 ​​и шесть серотип-специфических праймеров (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 и aFT9), которые расположены в шести вариабельных областях гена 9 и соответствуют G-серотипам 1, 2, 3, 4, 8 и 9. , используются во втором усилении. Вкратце, 5 мкл РНК с 25 пмоль каждого праймера Beg9 и End9 денатурируют в течение 5 мин при 97°C и охлаждают на льду. Затем 8 мкл реакционной смеси RT, содержащей 1,5 мкл буфера 10X PCR (500 мМ KCl, 100 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 2 мкл 25 мМ MgCl2, 2 мкл 2,5 мМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 10 ЕД обратной транскриптазы AMV (Promega) и 20 ЕД ингибитора рибонуклеазы РНКазина (Promega) добавляют к смеси образец-праймер и инкубируют при 42°C в течение 60 мин. К реакции RT добавляют буферную смесь для ПЦР (35 мкл), содержащую 3,5 мкл 10X буфера для ПЦР, 2 мкл 2,5 мМ dATP персика, dCTP, dGTP и dTTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq (Perkin Elmer) и 27 мкл воды. Реакционную смесь денатурируют при 94°С в течение 3 мин, затем проводят 30 циклов (1 мин при 94°С, 2 мин при 42°С, 3 мин при 72°С) и окончательное удлинение 5 мин при 72°С. .

Продукты первого раунда ПЦР (2 мкл) переносят в 48 мкл второй реакционной смеси для ПЦР, содержащей 5 мкл 10X буфера для ПЦР, по 25 пмоль каждого праймера aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 и RVG9, по 0,2 мМ каждого dATP. , dGTP, dCTP и dTTP, 2 мМ MgCl2, 2,5 ЕД полимеразы Taq. Условия повторного цикла идентичны первому, за исключением того, что выполняется только 25 циклов. Продукты ПЦР анализируют с помощью гель-электрофореза для определения ожидаемой длины амплифицированного VP7, что позволяет определить генотип. Другие наборы праймеров, условия ПЦР и/или секвенирование используются для определения генотипа, когда/если первоначальные праймеры не работают.

4 Определение генотипа VP4. Стратегия ПЦР-типирования гена 4 в принципе идентична той, что используется для VP7.64 Синтез первой цепи (обратная транскрипция) использует преимущества высококонсервативных областей VP4 с использованием праймеров Con2 и Con3 (вставка 3), которые комплементарны 3'-концы обеих цепей вирусной РНК в сегменте гена 4. От 1 до 5 мкл вирусной РНК добавляют в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл, содержащие 3,5 мкл диметилсульфоксида (Sigma) в конечном объеме 8,5 мкл, и образцы перемешивают и денатурируют при 97°С в течение 5 мин. Затем образцы охлаждают на льду в течение 5 мин и собирают путем кратковременного центрифугирования. 13,5 мкл H2O, 16 мкл дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 1,25 мМ dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 5 мкл буфера 1OX (100 мМ трис-гидрохлорид [pH 8,3], 500 мМ KCl) (Perkin-Elmer Cetus), Затем в каждую пробирку для образцов денатурированной дцРНК добавляют 3,5 мкл 25 мМ MgCl2, 2 мкл праймера (содержащего по 25 мкМ каждого праймера, Con 2 и Con 3) и 9 ед. обратной транскриптазы (чтобы получить конечный реакционный объем 49 мкл). ) и инкубировали при 42oC в течение 60 минут.

После добавления 1 мкл (1,9 ЕД) Taq-полимеразы и 100 мкл минерального масла проводят первый цикл ПЦР в течение 30 циклов (1 мин при 94°С, 2 мин при 50°С и 2 мин при 72°С). Цикл охлаждения используется для доведения образцов до 17°С по завершении эксперимента. Реакцию типирования второго раунда, если проводят с использованием от 0,5 до 5 мкл продукта первого раунда (5 мкл, если нет видимого продукта; 0,5 мкл, если продукт виден), смешивают с 45 мкл реакционной смеси в конечном объеме 50 мкл. Если добавляется менее 5 мкл продукта первого раунда, оставшийся объем для завершения 50 мкл составляет 10 мМ TrisHCl (pH 8,3) - 2,5 мМ. MgCl-2. Реакционная смесь: 19,5 мкл воды, 16 мкл dNTP, 5 мкл 10X буфера II, 3 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл коктейля праймеров (содержащего по 20 мкМ каждого из Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, и 4T-1) и 0,5 мкл (2,5 ЕД) Taq. Образцы покрывают минеральным маслом и проводят через 25 циклов ПЦР (те же циклы, что и в первом раунде). Затем образцы анализируют с помощью гель-электрофореза, и размер продукта позволяет определить генотип VP4. Другие наборы праймеров и/или секвенирование используются для различения генотипа, когда/если первоначальные праймеры не работают.

5 Определение уровней витамина А и цинка: Образцы сыворотки будут оцениваться на уровень витамина А с помощью ELISA (например, человеческий витамин А, EIAAB) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, планшет для микротитрования, входящий в этот набор, был предварительно покрыт антителом, специфичным к витамину А. Затем в соответствующие лунки планшета для микротитрования добавляются стандарты или образцы с биотин-конъюгированным препаратом поликлональных антител, специфичным для VA, и авидином, конъюгированным с хреном. В каждую лунку микропланшета добавляют пероксидазу (HRP) и инкубируют. Затем в каждую лунку добавляют раствор тетраметилбензидинового субстрата. Только те лунки, которые содержат витамин А, антитела, конъюгированные с биотином, и авидин, конъюгированные с ферментами, будут демонстрировать изменение цвета. Реакция фермент-субстрат останавливается добавлением H2SO4 и изменение цвета измеряется спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Затем определяют концентрацию VA в образцах путем сравнения O.D. образцов к стандартной кривой.

Уровни цинка будут измеряться в крови с использованием таких анализов, как простой колориметрический метод Лампуньяни, который использует спектрофотометрический метод с натриевой солью хромогена 4-(2-пиридилазо) резорцина для измерения концентрации цинка в сыворотке.