Przyczyny niepowodzenia szczepionki rotawirusowej u zambijskich dzieci

Badanie zostanie przeprowadzone w placówce zdrowia Kamwala w Lusace, gdzie znajdują się kliniki zdrowia matki dziecka (MCH) i terapii antyretrowirusowej (ART), a także jednostka badawcza Kamwala Centrum Badań nad Chorobami Zakaźnymi w Zambii (CIDRZ). Kamwala ma populację zlewni ponad 10 000, z około 30 nowymi niemowlętami zgłaszającymi się do MCH każdego miesiąca, przy wskaźnikach szczepień w wieku 6-14 tygodni (DPT-HiB-Hep) powyżej 95%. Asystent kliniki badawczej lub doradca rówieśniczy zwróci się do par matka-niemowlę podczas pierwszej wizyty w MCH z informacjami na temat tego badania w wybranym lokalnym języku. Osoby ogólnie zainteresowane zostaną zaproszone do pobliskiej kliniki badawczej w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji, podczas których zmotywowane matki zostaną zrekrutowane i poddane procesowi pisemnej świadomej zgody przez pielęgniarkę uczestniczącą w badaniu. W przypadku niepiśmiennych uczestników niezależna, piśmienna osoba będzie świadkiem i potwierdzi proces świadomej zgody. Prowadzony będzie specjalny dziennik zawierający informacje o datach i numerach osób zaproszonych na badanie oraz udokumentowane powody odmowy.

Starsza pielęgniarka badawcza, pielęgniarka badawcza i asystent badań klinicznych będą odpowiedzialni za świadomą zgodę i procedury rekrutacji pod nadzorem badacza. Pediatra będzie dostępny do konsultacji praktycznych w razie potrzeby.

Kontynuacja kohorty. Zarejestrowane matki zostaną poproszone o wypełnienie kwestionariuszy demograficznych i behawioralnych, formularza lokalizacyjnego uczestnika oraz poddanie się pobraniu krwi i mechanicznemu odciągowi mleka podczas wizyty rejestracyjnej w celu oznaczenia antyrotawirusowych IgG i IgA (w surowicy i mleku matki). Niemowlęta będą miały wyjściowe przeciwciała IgA i IgG przeciwko rotawirusowi, aby ustalić wyjściową ekspozycję na immunoglobulinę typu dzikiego i przezłożyskową, a następnie drugie oznaczenie IgA w surowicy jeden miesiąc po zakończeniu szczepienia przeciwko rotawirusowi (około 14-20 tygodni).

Niemowlęta będą następnie obserwowane co kwartał w klinice przez pozostałą część badania, a także będą odbywać tymczasowe wizyty w klinice, jeśli dziecko ma biegunkę. Podczas każdej wizyty dziecko zostanie zważone, zmierzone i wykonane zostaną pomiary antropometryczne, w tym fałd skórny pod kątem podskórnej tkanki tłuszczowej i obwód ramienia w połowie ramienia. Podczas wszelkich wizyt okresowych z objawami zostanie dokonana ocena nasilenia choroby (w skali Vesikari) oraz zostanie pobrana próbka kału w celu określenia antygenu i genotypu rotawirusa, jeśli rotawirus jest dodatni. Pacjent zostanie również odesłany do domu z dziennikiem biegunek, który należy wypełnić w ciągu następnych dwóch tygodni. Po zidentyfikowaniu dziecka z ciężkim zapaleniem żołądka i jelit, dobrana pod względem wieku grupa kontrolna z kohorty (bez niedawnego zapalenia żołądka i jelit) zostanie wprowadzona do pomiaru poziomu witaminy A i cynku w surowicy. Dzieci z zapaleniem żołądka i jelit będą leczone zgodnie z krajowymi wytycznymi (zgodnie ze zintegrowanym zarządzaniem chorobami wieku dziecięcego Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Jeżeli wymagane jest skierowanie, dziecko kierowane jest do poradni ambulatoryjnej lub w ciężkich przypadkach do Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego.

Procedury Studiów. Jak powyżej.

Metody laboratoryjne.

1. Wykrywanie swoistych dla rotawirusa IgA i IgG nastąpi za pomocą testu ELISA. Wykrywanie swoistych dla rotawirusa IgA i IgG nastąpi za pomocą testu ELISA. W skrócie procedura wygląda następująco. Dołki mikropłytek (np. Nunc Immuno I) inkubuje się z preparatami oczyszczonych antygenów wirusowych, następnie przemywa solą fizjologiczną buforowaną fosforanami z detergentem Tween (PBS-T). Próbki surowicy i mleka kobiecego rozcieńcza się seryjnie (w PBS-T zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej) i inkubuje na powlekanych mikropłytkach przez 2 godziny w temperaturze 37oC, a następnie przez noc w temperaturze 4oC. Następnie mikropłytki przemywa się i dodaje skoniugowane z peroksydazą przeciwciała anty-ludzkie IgA lub kozie IgG (Sigma Immunochemicals). Następnie reakcję kończy się za pomocą H2SO4 i mierzy się gęstość optyczną za pomocą czytnika płytek EIA. Wszystkie próbki bada się w dwóch powtórzeniach względem każdego antygenu wirusowego i antygenu kontrolnego. Studzienkę testową uznano za dodatnią na podstawie jej gęstości optycznej przy 450 nm, np. jeśli jest ona większa lub równa dwukrotności jej własnej kontroli. Swoistość kontroluje się poprzez włączenie studzienek zawierających antygen kontrolny inkubowanych bez próbki, a czułość sprawdza się poprzez włączenie studzienek zawierających antygen wirusowy inkubowanych w obecności próbek, o których wiadomo, że zawierają wysokie miano konkretnej klasy immunoglobulin specyficznych dla rotawirusa.
2. Wykrywanie antygenu rotawirusa nastąpi za pomocą testu Rotaclone ELISA. Próbki kału zostaną przebadane na obecność rotawirusa metodą ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) zgodnie ze specyfikacjami producenta. W skrócie, próbkę należy doprowadzić do temperatury pokojowej i rozcieńczyć buforowaną solą fizjologiczną z 0,02% tiomersolu. Rozcieńczona próbka i koniugat enzymu są następnie inkubowane z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko białku VP6 na mikropłytce Rotaclone. Następnie dodaje się bufory substratowe zawierające nadtlenek mocznika i tetrametylobenzydynę i reakcję zatrzymuje się za pomocą H2SO4. Następnie wykonuje się spektrofotometryczne oznaczenie wyniku przez pomiar absorbancji przy 450 nm względem ślepej próby powietrznej. Próbki z jednostkami absorbancji (A450) większymi niż 0,150 są uważane za dodatnie. Te z absorbancją równą lub niższą niż 0,150 są uważane za ujemne.

3 Określenie genotypu rotawirusa VP7. Wirusowy RNA ekstrahuje się z 10% zawiesiny materiału kałowego z dodatnim wynikiem antygenu rotawirusa w PBS (pH 7,0) przy użyciu odczynnika TRIzol™ (GIBCO Life Technologies) zgodnie z protokołem producenta. Wirusowe RNA jest następnie pobierane przez RT-PCR, jak opisano wcześniej.

Wyekstrahowany wirusowy RNA jest następnie poddawany zagnieżdżonej reakcji PCR z wykorzystaniem starterów, które są komplementarne do końców 3' obu nici wirusowego RNA w segmencie genu 9, który koduje wirusowe białko 7 (VP7). Te startery są używane do syntezy pierwszej nici. Starter RVG9 ​​i sześć starterów specyficznych dla serotypu (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 i aFT9), które znajdują się w sześciu regionach zmiennych genu 9 i odpowiadają serotypom G 1, 2, 3, 4, 8 i 9 , są używane w drugiej amplifikacji. Pokrótce, 5 µl RNA z 25 pmolami każdego startera Beg9 i End9 denaturuje się przez 5 min w 97°C i chłodzi na lodzie. Następnie 8 µl mieszaniny reakcyjnej RT zawierającej 1,5 µl 10X buforu do PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mM każdego dATP, dCTP, dGTP i Do mieszaniny próbka-primer dodaje się dTTP, 10 U AMV odwrotnej transkryptazy (Promega) i 20 U inhibitora rybonukleazy Rnazyny (Promega) i inkubuje w 42°C przez 60 min. Mieszaninę buforów do PCR (35 µl), zawierającą 3,5 µl 10X buforu do PCR, 2 µl 2,5 mM brzoskwiniowego dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 2,5 U polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer) i 27 µl wody dodaje się do reakcji RT. Mieszaninę reakcyjną poddaje się denaturacji w temperaturze 94°C przez 3 min, po czym następuje 30 cykli (1 min w 94°C, 2 min w 42°C, 3 min w 72°C) i końcowe wydłużanie przez 5 min w 72°C .

Produkty PCR pierwszej rundy (2 µl) przenosi się do 48 µl drugiej mieszaniny reakcyjnej PCR, zawierającej 5 µl 10X buforu PCR, po 25 pmol każdy starterów aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 i RVG9, każdy 0,2 mM dATP , dGTP, dCTP i dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U polimerazy Taq. Warunki kolarskie drugiej rundy są identyczne jak w pierwszej rundzie, z wyjątkiem tego, że odbywa się tylko 25 cykli. Produkty PCR analizuje się metodą elektroforezy żelowej w celu zidentyfikowania oczekiwanych długości zamplifikowanego VP7, co pozwala na określenie genotypu. Inne zestawy starterów, warunki PCR i/lub sekwencjonowanie są używane do rozróżnienia genotypu, kiedy/jeśli początkowe startery zawiodą.

4 Określenie genotypu VP4. Strategia typowania PCR genu 4 jest w zasadzie identyczna jak strategia zastosowana w przypadku VP7.64 Synteza pierwszej nici (odwrotna transkrypcja) wykorzystuje wysoce konserwatywne obszary VP4 z wykorzystaniem starterów Con2 i Con3 (ramka 3), które są komplementarne do końce 3' obu nici wirusowego RNA w segmencie genu 4. 1 do 5 µl wirusowego RNA dodaje się do 0,5 ml probówek do mikrowirówki zawierających 3,5 µl dimetylosulfotlenku (Sigma) w końcowej objętości 8,5 µl, a próbki miesza się i denaturowany w temperaturze 97°C przez 5 min. Następnie próbki chłodzi się na lodzie przez 5 minut i zbiera przez krótkie odwirowanie. 13,5 µl H2O, 16 µl trójfosforanów deoksynukleozydów (po 1,25 mM dATP, dGTP, dCTP i dTTP), 5 µl buforu 1OX (100 mM chlorowodorek Tris [pH 8,3], 500 mM KCl) (Perkin-Elmer Cetus), Następnie do każdej probówki z denaturowaną próbką dsRNA dodaje się 3,5 µl 25 mM MgCl2, 2 µl startera (zawierającego 25 µM każdego startera, Con 2 i Con 3) i 9 U odwrotnej transkryptazy (aby uzyskać końcową objętość reakcyjną 49 µl ) i inkubowano w 42oC przez 60 minut.

Po dodaniu 1 µL (1,9 U) polimerazy Taq i 100 µL oleju mineralnego przeprowadza się pierwszą rundę PCR przez 30 cykli (1 min 94oC, 2 min w 50oC i 2 min w 72oC. Cykl chłodzenia stosuje się w celu doprowadzenia próbek do 17°C po zakończeniu doświadczenia. Reakcja typowania drugiej rundy, jeśli jest przeprowadzana przy użyciu 0,5 do 5 µl produktu z pierwszej rundy (5 µl, jeśli produkt nie jest widoczny; 0,5 µl, jeśli produkt jest widoczny) miesza się z 45 µl mieszaniny reakcyjnej w końcowej objętości 50 µl. Jeśli doda się mniej niż 5 µl produktu z pierwszej rundy, pozostała objętość do uzupełnienia 50 µl wynosi 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM MgCl¬2. Mieszanina reakcyjna składa się z 19,5 µl wody, 16 µl dNTP, 5 µl 10X Buffer II, 3 µl 25 mM MgCl2, 1 µl koktajlu starterów (zawierającego po 20 µM Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, i 4T-1) i 0,5 ul (2,5 U) Taq. Próbki pokrywa się olejem mineralnym i poddaje 25 rundom PCR (takie same cykle jak w pierwszej rundzie). Próbki są następnie analizowane za pomocą elektroforezy żelowej, a wielkość produktu umożliwia określenie genotypu VP4. Inne zestawy starterów i/lub sekwencjonowanie stosuje się do rozróżnienia genotypu, kiedy/jeśli początkowe startery zawiodą.

5 Oznaczanie poziomu witaminy A i cynku: Próbki surowicy zostaną ocenione pod kątem poziomu witaminy A za pomocą testu ELISA (np. ludzka witamina A, EIAAB) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, płytka do mikromiareczkowania dostarczona w tym zestawie została wstępnie pokryta przeciwciałem specyficznym dla witaminy A. Standardy lub próbki są następnie dodawane do odpowiednich studzienek płytki do mikromiareczkowania z preparatem przeciwciała poliklonalnego skoniugowanego z biotyną swoistym dla VA i awidyny skoniugowanej z chrzanem Do każdej studzienki mikropłytki dodaje się peroksydazę (HRP) i inkubuje. Następnie do każdego dołka dodaje się roztwór substratu tetrametylobenzydyny. Tylko te studzienki, które zawierają witaminę A, przeciwciało skoniugowane z biotyną i awidynę skoniugowaną z enzymem będą wykazywać zmianę koloru. Reakcję enzym-substrat zatrzymuje się przez dodanie H2SO4, a zmianę barwy mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm. Stężenie VA w próbkach jest następnie określane przez porównanie OD. próbek do krzywej wzorcowej.

Poziomy cynku będą mierzone we krwi za pomocą testów, takich jak prosta metoda kolorymetryczna Lampugnaniego, która wykorzystuje metodę spektrofotometryczną z solą sodową chromogenu 4-(2-pirydylazo)rezorcyny do pomiaru stężenia cynku w surowicy.