Ursachen für das Versagen der Rotavirus-Impfung bei sambischen Kindern

Die Studie wird in der Gesundheitseinrichtung Kamwala in Lusaka durchgeführt, wo sich die Kliniken für Maternal Child Health (MCH) und antiretrovirale Therapie (ART) sowie die Kamwala Research Unit des Center for Infectious Disease Research Zambia (CIDRZ) befinden. Kamwala hat eine Einzugsgebietsbevölkerung von über 10.000 Einwohnern, wobei jeden Monat etwa 30 neue Säuglinge bei MCH vorgestellt werden und die Impfraten nach 6–14 Wochen (DPT-HiB-Hep) über 95 % liegen. Mutter-Kind-Paare werden beim ersten Besuch bei MCH vom Assistenten der Studienklinik oder vom Peer-Berater mit Informationen zu dieser Studie in der Landessprache ihrer Wahl angesprochen. Generell Interessierte werden für detailliertere Informationen in die nahegelegene Forschungsklinik eingeladen. Dort werden motivierte Mütter rekrutiert und von der Studienkrankenschwester durch den Prozess der schriftlichen Einwilligung nach Aufklärung geführt. Bei analphabetischen Teilnehmern wird eine unabhängige, gebildete Person den Prozess der Einwilligung nach Aufklärung bezeugen und validieren. Es wird ein spezielles Protokoll geführt, das Informationen über Datum und Anzahl der zur Studie eingeladenen Personen enthält und die Gründe für die Ablehnung dokumentiert.

Eine leitende Forschungskrankenschwester, eine Studienkrankenschwester und ein klinischer Forschungsassistent sind unter der Aufsicht des Prüfarztes für die Einverständniserklärung und die Registrierungsverfahren verantwortlich. Bei Bedarf steht Ihnen ein Kinderarzt für eine praktische Beratung zur Verfügung.

Kohorten-Follow-up. Eingeschriebene Mütter werden gebeten, demografische Fragebögen und Verhaltensfragebögen sowie ein Formular zur Teilnehmersuche auszufüllen und sich beim Einschreibungsbesuch einer Aderlass- und mechanischen Absaugung der Muttermilch zur Bestimmung von Anti-Rotavirus-IgG und IgA (in Serum und Muttermilch) zu unterziehen. Bei Säuglingen werden zunächst Anti-Rotavirus-IgA- und IgG-Antikörper bestimmt, um die Ausgangsexposition gegenüber Wildtyp- und transplazentarem Immunglobulin festzustellen. Anschließend erfolgt eine zweite Serum-IgA-Bestimmung einen Monat nach Abschluss der Rotavirus-Impfung (ca. 14–20 Wochen).

Die Säuglinge werden dann für den Rest der Studie vierteljährlich in der Klinik beobachtet und machen auch zwischenzeitliche Klinikbesuche, wenn das Kind Durchfall hat. Bei jedem Besuch wird das Kind gewogen, seine Größe gemessen und anthropometrische Daten erfasst, einschließlich der Hautfalte für subkutanes Körperfett und des mittleren Oberarmumfangs. Bei allen symptomatischen Zwischenbesuchen wird der Schweregrad der Erkrankung beurteilt (anhand der Vesikari-Skala) und eine Stuhlprobe wird zur Bestimmung des Rotavirus-Antigens und des Genotyps entnommen, wenn Rotavirus-positiv ist. Der Patient wird außerdem mit einem Durchfalltagebuch nach Hause geschickt, das in den folgenden zwei Wochen geführt wird. Nach der Identifizierung eines Kindes mit schwerer Gastroenteritis wird eine altersentsprechende Kontrollgruppe aus der Kohorte (ohne kürzlich aufgetretene Gastroenteritis) zur Messung des Vitamin-A- und Serumzinkspiegels hinzugezogen. Kinder mit Gastroenteritis werden gemäß den nationalen Richtlinien behandelt (gemäß „Integrated Management of Childhood Illness“ der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Wenn eine Überweisung erforderlich ist, wird das Kind in die Ambulanz oder in schwerwiegenden Fällen an das Universitätsklinikum überwiesen.

Studienabläufe. Das gleiche wie oben.

Labormethoden.

1. Der Nachweis von Rotavirus-spezifischem IgA und IgG erfolgt mittels ELISA. Der Nachweis von Rotavirus-spezifischem IgA und IgG erfolgt mittels ELISA. Kurz gesagt ist das Verfahren wie folgt. Mikroplattenvertiefungen (z. B. Nunc Immuno I) werden mit gereinigten viralen Antigenpräparaten inkubiert und dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Tween-Detergens (PBS-T) gewaschen. Serum- und Muttermilchproben werden seriell verdünnt (in PBS-T mit 1 % Rinderserumalbumin) und in den beschichteten Mikrotiterplatten 2 Stunden lang bei 37 °C und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend werden die Mikrotiterplatten gewaschen und mit Peroxidase konjugierte Anti-Human-IgA- oder IgG-Ziegenantikörper (Sigma Immunochemicals) hinzugefügt. Die Reaktion wird dann mit H2SO4 beendet und die optische Dichte wird mit einem EIA-Plattenlesegerät gemessen. Alle Proben werden doppelt gegen jedes virale Antigen und gegen ein Kontrollantigen getestet. Eine Testvertiefung wurde aufgrund ihrer optischen Dichte bei 450 nm als positiv angesehen, wenn sie beispielsweise größer oder gleich dem Zweifachen der eigenen Kontrolle war. Die Spezifität wird kontrolliert, indem Vertiefungen mit Kontrollantigenen einbezogen werden, die in Abwesenheit der Probe inkubiert wurden, und die Empfindlichkeit wird überprüft, indem Vertiefungen mit viralen Antigenen einbezogen werden, die in Gegenwart von Proben inkubiert wurden, von denen bekannt ist, dass sie einen hohen Titer einer bestimmten Rotavirus-spezifischen Immunglobulinklasse enthalten.
2. Der Nachweis des Rotavirus-Antigens erfolgt durch Rotaclone ELISA. Stuhlproben werden mittels ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) gemäß den Herstellerangaben auf Rotavirus getestet. Kurz gesagt, die Probe wird auf Raumtemperatur gebracht und mit gepufferter Kochsalzlösung mit 0,02 % Thimerosol verdünnt. Verdünnte Probe und Enzymkonjugat werden dann mit einem monoklonalen Antikörper gegen das VP6-Protein in der Rotaclone-Mikrotiterplatte inkubiert. Anschließend werden Substratpuffer mit Harnstoffperoxid und Tetramethylbenzidin zugegeben und die Reaktion mit H2SO4 beendet. Die spektrophotometrische Bestimmung des Ergebnisses erfolgt dann durch Messung der Absorption bei 450 nm gegen einen Luftblindwert. Proben mit Absorptionseinheiten (A450) von mehr als 0,150 gelten als positiv. Diejenigen mit einer Extinktion von 0,150 oder weniger gelten als negativ.

3 Bestimmung des Rotavirus VP7-Genotyps. Virale RNA wird aus einer 10 %igen Suspension von Rotavirus-Antigen-positivem Fäkalienmaterial in PBS (pH 7,0) mit TRIzolTM-Reagenz (GIBCO Life Technologies) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Virale RNA wird dann wie zuvor beschrieben durch RT-PCR entnommen.

Extrahierte virale RNA wird dann durch verschachtelte PCR unter Verwendung von Primern entnommen, die zu den 3'-Enden beider viraler RNA-Stränge innerhalb des Gensegments 9, das das virale Protein 7 (VP7) kodiert, komplementär sind. Diese Primer werden für die Erststrangsynthese verwendet. Primer RVG9 ​​und sechs Serotyp-spezifische Primer (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 und aFT9), die sich in sechs variablen Regionen auf dem Gen 9 befinden und den G-Serotypen 1, 2, 3, 4, 8 und 9 entsprechen , werden in der zweiten Verstärkung verwendet. Kurz gesagt, 5 µl RNA mit 25 pmol jedes Primers Beg9 und End9 werden 5 Minuten lang bei 97 °C denaturiert und auf Eis gekühlt. Danach wurden 8 µl RT-Reaktionsgemisch mit 1,5 µl 10X PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl jeweils 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP usw. hinzugefügt dTTP, 10 U AMV-Reverse-Transkriptase (Promega) und 20 U Rnasin-Ribonuklease-Inhibitor (Promega), werden zur Proben-Primer-Mischung gegeben und 60 Minuten bei 42 °C inkubiert. PCR-Puffermischung (35 µl), enthaltend 3,5 µl 10X PCR-Puffer, 2 µl 2,5 mM Pfirsich-dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 27 µl Wasser, werden zur RT-Reaktion gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Minuten lang bei 94 °C denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen (1 Minute bei 94 °C, 2 Minuten bei 42 °C, 3 Minuten bei 72 °C) und einer abschließenden Verlängerung von 5 Minuten bei 72 °C .

PCR-Produkte der ersten Runde (2 µl) werden in 48 µl der zweiten PCR-Reaktionsmischung übertragen, die 5 µl 10X PCR-Puffer, jeweils 25 pmol Primer aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 und RVG9, jeweils 0,2 mM dATP enthält , dGTP, dCTP und dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U Taq-Polymerase. Die Radbedingungen in der zweiten Runde sind identisch mit denen in der ersten Runde, mit der Ausnahme, dass nur 25 Zyklen gefahren werden. Die PCR-Produkte werden mittels Gelelektrophorese analysiert, um die erwarteten Längen des amplifizierten VP7 zu identifizieren und so den Genotyp zu bestimmen. Andere Primersätze, PCR-Bedingungen und/oder Sequenzierung werden verwendet, um den Genotyp zu unterscheiden, wenn die anfänglichen Primer versagen.

4 Bestimmung des VP4-Genotyps. Die Strategie für die PCR-Typisierung von Gen 4 ist im Prinzip identisch mit der für VP7.64. Die Erststrangsynthese (reverse Transkription) nutzt hochkonservierte Bereiche von VP4 unter Verwendung der Primer Con2 und Con3 (Kasten 3), die komplementär sind die 3'-Enden beider viraler RNA-Stränge innerhalb des Gensegments 4. 1 bis 5 µL virale RNA werden in 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 3,5 µl Dimethylsulfoxid (Sigma) in einem Endvolumen von 8,5 µl gegeben, und die Proben werden gemischt und 5 Min. bei 97°C denaturiert. Anschließend werden die Proben 5 min auf Eis gekühlt und durch kurzes Zentrifugieren gesammelt. 13,5 µL H20, 16 µL Desoxynukleosidtriphosphate (jeweils 1,25 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 5 µL 1OX-Puffer (100 mM Tris-Hydrochlorid [pH 8,3], 500 mM KCl) (Perkin-Elmer Cetus), 3,5 µl 25 mM MgCl2, 2 µl Primer (enthaltend 25 µM jedes Primers, Con 2 und Con 3) und 9 U Reverse Transkriptase werden dann zu jedem denaturierten dsRNA-Probenröhrchen gegeben (um ein Endreaktionsvolumen von 49 µ1 zu ergeben). ) und 60 Minuten bei 42 °C inkubiert.

Nach der Zugabe von 1 µL (1,9 U) Taq-Polymerase und 100 µL Mineralöl wird die erste PCR-Runde über 30 Zyklen durchgeführt (1 Minute bei 94 °C, 2 Minuten bei 50 °C und 2 Minuten bei 72 °C). Ein Kühlzyklus wird verwendet, um die Proben nach Abschluss des Experiments auf 17 °C zu bringen. Die Typisierungsreaktion der zweiten Runde wird mit 0,5 bis 5 µL des Produkts der ersten Runde (5 µL, wenn kein sichtbares Produkt; 0,5 µL, wenn sichtbares Produkt) mit 45 µL Reaktionsmischung in einem Endvolumen von 50 µL gemischt. Wenn weniger als 5 µL des Erstrundenprodukts hinzugefügt werden, beträgt das verbleibende Volumen, um 50 µL zu vervollständigen, 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM MgCl¬2. Die Reaktionsmischung besteht aus 19,5 µL Wasser, 16 µL dNTPs, 5 µL 10X Puffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL des Primer-Cocktails (enthält jeweils 20 µM Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, und 4T-1) und 0,5 µL (2,5 U) Taq. Die Proben werden mit Mineralöl überschichtet und 25 PCR-Runden unterzogen (dieselben Zyklen wie in der ersten Runde). Die Proben werden dann durch Gelelektrophorese analysiert und die Produktgröße ermöglicht die Bestimmung des VP4-Genotyps. Andere Primersätze und/oder Sequenzierung werden verwendet, um den Genotyp zu unterscheiden, wenn die anfänglichen Primer versagen.

5 Bestimmung des Vitamin-A- und Zinkspiegels: Serumproben werden mittels ELISA (z. B. menschliches Vitamin A, EIAAB) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den Vitamin-A-Spiegel untersucht. Kurz gesagt, die in diesem Kit enthaltene Mikrotiterplatte wurde mit einem für Vitamin A spezifischen Antikörper vorbeschichtet. Anschließend werden Standards oder Proben mit einem für VA spezifischen Biotin-konjugierten polyklonalen Antikörperpräparat und an Meerrettich konjugiertem Avidin in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben Peroxidase (HRP) wird in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und inkubiert. Anschließend wird in jede Vertiefung eine Tetramethylbenzidin-Substratlösung gegeben. Nur die Vertiefungen, die Vitamin A, Biotin-konjugierten Antikörper und Enzym-konjugiertes Avidin enthalten, weisen eine Farbveränderung auf. Die Enzym-Substrat-Reaktion wird durch Zugabe von H2SO4 beendet und der Farbumschlag spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die VA-Konzentration in den Proben wird dann durch Vergleich der O.D. bestimmt. der Proben zur Standardkurve.

Der Zinkspiegel wird im Blut mithilfe von Tests wie der einfachen kolorimetrischen Methode von Lampugnani gemessen, bei der eine spektrophotometrische Methode mit dem Chromogen 4-(2-Pyridylazo)-Resorcin-Natriumsalz zur Messung der Serumzinkkonzentrationen verwendet wird.