A rotavírus elleni vakcina sikertelenségének okai zambiai gyermekeknél

A vizsgálatot a lusakai Kamwala egészségügyi intézményben végzik, ahol az anyai gyermekegészségügyi (MCH) és az antiretrovirális terápiás (ART) klinikák, valamint a Zambiai Fertőző Betegségek Kutatóközpontja (CIDRZ) Kamwala Kutatóegysége található. Kamwala lakossága több mint 10 000, havonta körülbelül 30 új csecsemő jelentkezik MCH-ra, és a 6-14 hetes (DPT-HiB-Hep) immunizálási arány meghaladja a 95%-ot. Az anya-csecsemő párokat az MCH-nál tett első látogatás során a vizsgálati klinika asszisztense vagy kortárs tanácsadója felkeresi, és a választott helyi nyelven tájékoztatja a vizsgálatról. Az általánosan érdeklődőket a közeli kutatási klinikára hívjuk meg, ahol részletesebb tájékoztatást kapnak, melynek során a motivált anyákat toborozzák és a vizsgálati ápolónő írásos beleegyezési eljáráson keresztül vezeti be. Az írástudatlan résztvevők esetében egy független, írástudó egyén lesz tanúja és érvényesíti a tájékozott beleegyezési folyamatot. Külön naplót vezetnek, amely tartalmazza a vizsgálatba meghívottak dátumát és számát, valamint az elutasítás indokait.

Egy vezető kutatónővér, vizsgálati nővér és klinikai kutatási asszisztens felelős a tájékozott beleegyezésért és a felvételi eljárásokért a vizsgáló felügyelete mellett. Szükség esetén gyermekorvos is rendelkezésre áll gyakorlati konzultációra.

Kohorsz nyomon követése. A beiratkozott anyákat felkérik, hogy töltsenek ki demográfiai és viselkedési kérdőíveket, egy résztvevő lokátor űrlapot, és essenek át flebotómián és anyatej mechanikai expresszióján a beiratkozási vizit alkalmával, hogy meghatározzák az anti-rotavírus IgG és IgA (szérumban és anyatejben). A csecsemőknél meghatározzák a rotavírus elleni IgA és IgG kiindulási antitesteket, hogy megállapítsák a vad típusú és transzplacentális immunglobulin kiindulási expozícióját, majd egy második szérum IgA meghatározást egy hónappal a rotavírus vakcinázás befejezése után (körülbelül 14-20 héten belül).

A csecsemőket ezután negyedévente követik a klinikán a vizsgálat hátralévő részében, és ideiglenes klinikai látogatásokat is végeznek, ha a gyermeknek hasmenése van. Minden látogatáskor megmérik a gyermek súlyát, megmérik a magasságát, és antropometriát vesznek, beleértve a bőrredőt a bőr alatti testzsír és a felkar közepén. A tünetekkel járó időközi látogatások során felmérik a betegség súlyosságát (Veskari skála alapján), és székletmintát vesznek a rotavírus antigén és a genotípus meghatározásához, ha rotavírus pozitív. A beteget egy hasmenési naplóval is hazaküldik, amelyet a következő két hétben kell kitölteni. Súlyos gyomor-bélhurutban szenvedő gyermek azonosítását követően a kohorszon belüli életkornak megfelelő kontrollt (a közelmúltban nem fordult elő gasztroenteritisz) behoznak az A-vitamin és a szérum cinkszint mérésére. A gyomor-bélhurutban szenvedő gyermekek kezelése a nemzeti irányelvek szerint történik (az Egészségügyi Világszervezet (WHO) gyermekbetegségek integrált kezelése szerint). Ha beutaló szükséges, a gyermeket járóbeteg szakrendelésre, súlyos esetben az Egyetemi Oktatókórházba utalják.

Tanulmányi eljárások. Ugyanaz, mint fent.

Laboratóriumi módszerek.

1. A rotavírus-specifikus IgA és IgG kimutatása ELISA-val történik. A rotavírus-specifikus IgA és IgG kimutatása ELISA-val történik. Az eljárás röviden a következő. A mikrolemez üregeit (például Nunc Immuno I) tisztított vírusantigén-preparátumokkal inkubáljuk, majd foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk Tween detergenssel (PBS-T). A szérum- és anyatejmintákat sorozathígítjuk (1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó PBS-T-ben), és a bevont mikrolemezeken 2 órán át 37 oC-on, majd egy éjszakán át 4 oC-on inkubáljuk. A mikrolemezeket ezután mossuk, és peroxidázzal konjugált anti-humán IgA vagy IgG kecske antitesteket (Sigma Immunochemicals) adunk hozzá. A reakciót ezután H2SO4-gyel leállítjuk, és az optikai sűrűséget EIA lemezleolvasóval mérjük. Minden mintát két párhuzamosban vizsgálunk mindegyik vírusantigénnel és egy kontrollantigénnel szemben. A tesztüreg 450 nm-en mért optikai sűrűsége alapján tekinthető pozitívnak, például ha nagyobb vagy egyenlő a saját kontrollénak kétszerese vagy azzal egyenlő. A specifitást a minta hiányában inkubált kontrollantigént tartalmazó lyukak beiktatásával ellenőrizzük, az érzékenységet pedig úgy ellenőrizzük, hogy olyan üregeket tartalmaznak, amelyek virális antigént tartalmaznak, és olyan minták jelenlétében inkubáljuk, amelyekről ismert, hogy egy adott rotavírus-specifikus immunglobulin osztály magas titerét tartalmazzák.
2. A rotavírus-antigén kimutatása Rotaclone ELISA-val történik. A székletmintákat a gyártó előírásai szerint ELISA-val (Rotaclone®, Meridian Biosciences) teszteljük rotavírusra. Röviden, a mintát szobahőmérsékletre melegítjük, és 0,02% timeroszolt tartalmazó pufferolt sóoldattal hígítjuk. A hígított mintát és az enzimkonjugátumot ezután a VP6 fehérje elleni monoklonális antitesttel inkubáljuk a Rotaclone mikrolemezen. Ezután karbamid-peroxidot és tetrametil-benzidint tartalmazó szubsztrátumpuffereket adunk hozzá, és a reakciót H2SO4-gyel leállítjuk. Ezután az eredmény spektrofotometriás meghatározását végezzük úgy, hogy az abszorbanciát 450 nm-en egy levegős vakpróbával szemben mérjük. A 0,150-nél nagyobb abszorbanciaegységekkel (A450) rendelkező minták pozitívnak tekintendők. Azok, amelyek abszorbanciája 0,150 vagy kisebb, negatívnak minősülnek.

3 A Rotavírus VP7 genotípusának meghatározása. A vírus RNS-t a rotavírus antigén-pozitív bélsár 10%-os szuszpenziójából PBS-ben (pH 7,0) extraháljuk TRIzolTM Reagent (GIBCO Life Technologies) segítségével a gyártó protokollja szerint. A vírus RNS-t ezután RT-PCR-en keresztül veszik át a korábban leírtak szerint.

Az extrahált vírus-RNS-t ezután beágyazott PCR-en keresztül veszik át, olyan primerek felhasználásával, amelyek komplementerek a 7. virális proteint (VP7) kódoló 9. génszegmensen belül mindkét virális RNS-szál 3'-végéhez. Ezeket a primereket az első szál szintéziséhez használják. RVG9 primer és hat szerotípus-specifikus primer (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 és aFT9), amelyek a 9-es gén hat variábilis régiójában találhatók, és megfelelnek az 1-es, 2-es, 3-as, 4-es, 8-as és 9-es G-szerotípusnak. , a második erősítésben használatosak. Röviden, 5 µl RNS-t 25 pmol Beg9 és End9 primerrel denaturálunk 5 percig 97 °C-on, és jégen lehűtjük. Ezt követően 8 µl RT reakcióelegy, amely 1,5 µl 10X PCR puffert (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mM, dGTP, dTPdAT és dGTPdAT dTTP-t, 10 U AMV reverz transzkriptázt (Promega) és 20 U Rnasin ribonukleáz inhibitort (Promega) adunk a minta-primer keverékhez, és 42 °C-on 60 percig inkubáljuk. 3,5 µl 10X PCR puffert, 2 µl 2,5 mM őszibarack dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t, 2,5 U AmpliTaq DNS polimerázt (Perkin Elmer) és 27 µl RT reakcióelegyet tartalmazó PCR puffer keveréket (35 µl) adunk. A reakcióelegyet 94 °C-on 3 percig denaturáljuk, majd 30 ciklust (1 perc 94 °C-on, 2 perc 42 °C-on, 3 perc 72 °C-on) és a végső meghosszabbítás 5 percig 72 °C-on. .

Az első körös PCR-termékeket (2 µl) átvisszük 48 µl második PCR-reakcióelegybe, amely 5 µl 10X PCR-puffert tartalmaz, egyenként 25 pmol aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 és RVG9 ​​primereket, mindegyik 0,2 mM dATP. dGTP, dCTP és dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U Taq polimeráz. A második kör kerékpározási feltételei megegyeznek az első körrel, kivéve, hogy csak 25 ciklust kell lefutni. A PCR-termékeket gélelektroforézissel elemezzük, hogy azonosítsuk az amplifikált VP7 várható hosszát, lehetővé téve a genotípus meghatározását. Más primer-készleteket, PCR-körülményeket és/vagy szekvenálást használnak a genotípus megkülönböztetésére, amikor/ha a kezdeti primerek sikertelenek.

4 VP4 genotípus meghatározása. A 4-es gén PCR-tipizálásának stratégiája elvileg megegyezik a VP7-nél alkalmazott stratégiával. Az első szál szintézise (reverz transzkripció) kihasználja a VP4 erősen konzervált területeit a Con2 és Con3 primerek felhasználásával (3. doboz), amelyek kiegészítik a VP7-t. mindkét vírus RNS szál 3' vége a 4. génszegmensen belül. 1-5 µl virális RNS-t adunk 0,5 ml-es mikrocentrifuga csövekbe, amelyek 3,5 µl dimetil-szulfoxidot (Sigma) tartalmaznak 8,5 µl végső térfogatban, majd a mintákat összekeverjük és 97 °C-on 5 percig denaturáltuk. A mintákat ezután jégen hűtjük 5 percig, és rövid centrifugálással összegyűjtjük. 13,5 µl H20, 16 µl dezoxinukleozid-trifoszfát (1,25 mM dATP, dGTP, dCTP és dTTP mindegyike), 5 µL 1OX puffer (100 mM Tris-hidroklorid [pH 8,03], K-Cl003), K-Cl003 Ezután 3,5 µl 25 mM MgCl2-t, 2 µl primert (25 µM minden primerből, Con 2-ből és Con 3-ból) és 9 U reverz transzkriptázt adunk minden denaturált dsRNS mintacsőhöz (hogy a végső reakciótérfogat 49 µ1 legyen ) és 42 °C-on 60 percig inkubáltuk.

1 µL (1,9 U) Taq polimeráz és 100 µL ásványolaj hozzáadása után az első körös PCR-t 30 cikluson keresztül végezzük (1 perc 94 oC, 2 perc 50 oC és 2 perc 72 oC). Hűtési ciklust alkalmazunk, hogy a mintákat 17°C-ra melegítsük a kísérlet végén. A második körös tipizálási reakciót 0,5-5 µl első körös termék felhasználásával (5 µL, ha nincs látható termék; 0,5 µL, ha látható termék) 45 µL reakciókeverékkel keverjük össze 50 µl végső térfogatban. Ha kevesebb, mint 5 µl első körben lévő terméket adunk hozzá, a maradék térfogat 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM, hogy 50 µl legyen. MgCl¬2. A reakcióelegy 19,5 µl víz, 16 µl dNTP, 5 µL 10X puffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µl primer koktél (20 µM Con3, 1T-1, 3T-1, 1T-1, 3T-1 és 4T-1), és 0,5 µl (2,5 U) Taq. A mintákat ásványolajjal fedjük be, és 25 PCR-cikluson (ugyanazok a ciklusokon, mint az első körön) vettük át. A mintákat ezután gélelektroforézissel elemzik, és a termék mérete lehetővé teszi a VP4 genotípus meghatározását. Más primer készleteket és/vagy szekvenálást használnak a genotípus megkülönböztetésére, amikor/ha a kezdeti primerek sikertelenek.

5 Az A-vitamin és a cink szintjének meghatározása: A szérumminták A-vitamin szintjét ELISA-val (pl. Humán A-vitamin, EIAAB) értékelik a gyártó utasításai szerint. Röviden, az ebben a készletben található mikrotiterlemezt előzetesen bevonták egy A-vitaminra specifikus antitesttel. Ezután standardokat vagy mintákat adnak a megfelelő mikrotiterlemez üregeibe biotinnal konjugált poliklonális antitest-készítménysel, amely VA-ra specifikus, és tormához konjugált avidint. Minden mikrolemez lyukhoz peroxidázt (HRP) adunk, és inkubáljuk. Ezután tetrametil-benzidin szubsztrát oldatot adunk minden egyes üreghez. Csak az A-vitamint, biotinnal konjugált antitestet és enzim-konjugált avidint tartalmazó lyukak színe megváltozik. Az enzim-szubsztrát reakciót H2SO4 hozzáadásával leállítjuk, és a színváltozást spektrofotometriásan mérjük 450 nm hullámhosszon. Ezután a mintákban a VA koncentrációját az O.D. a mintákból a standard görbére.

A cinkszintet vérből mérik olyan tesztekkel, mint például a Lampugnani-féle egyszerű kolorimetriás módszer, amely spektrofotometriás módszert alkalmaz kromogén 4-(2-piridilazo)-rezorcin-nátriumsóval a szérum cinkkoncentrációjának mérésére.