Causes de l'échec du vaccin contre le rotavirus chez les enfants zambiens

L'étude sera menée dans l'établissement de santé de Kamwala à Lusaka, où se trouvent les cliniques de santé maternelle et infantile (MCH) et de thérapie antirétrovirale (TAR), ainsi que l'unité de recherche de Kamwala du Centre de recherche sur les maladies infectieuses de Zambie (CIDRZ). Kamwala a une population de plus de 10 000 personnes avec environ 30 nouveaux nourrissons se présentant à l'HME chaque mois avec des taux de vaccination de 6 à 14 semaines (DTC-HiB-Hep) supérieurs à 95 %. Les paires mère-enfant seront approchées lors de la visite initiale à SMI par l'assistant de la clinique de l'étude ou le conseiller pair avec des informations sur cette étude dans la langue locale de leur choix. Les personnes généralement intéressées seront invitées à la clinique de recherche située à proximité, pour des informations plus détaillées au cours desquelles des mères motivées seront recrutées et soumises au processus de consentement éclairé écrit par l'infirmière de l'étude. Pour les participants analphabètes, une personne indépendante et alphabétisée assistera et validera le processus de consentement éclairé. Un journal spécifique sera tenu pour afficher les informations sur les dates et le nombre de personnes invitées à l'étude, les motifs de refus documentés.

Une infirmière de recherche principale, une infirmière d'étude et une assistante de recherche clinique seront responsables des procédures de consentement éclairé et d'inscription sous la supervision de l'investigateur. Un pédiatre sera disponible pour une consultation pratique en cas de besoin.

Suivi de cohorte. Les mères inscrites seront invitées à remplir des questionnaires démographiques et comportementaux, un formulaire de localisation des participants et à subir une phlébotomie et une expression mécanique du lait maternel lors de la visite d'inscription pour la détermination des IgG et IgA anti-rotavirus (dans le sérum et le lait maternel). Les nourrissons auront des anticorps IgA et IgG anti-rotavirus de base déterminés pour déterminer l'exposition de base à l'immunoglobuline de type sauvage et transplacentaire, suivis d'une deuxième détermination des IgA sériques un mois après la fin de la vaccination contre le rotavirus (à environ 14 à 20 semaines).

Les nourrissons seront ensuite suivis trimestriellement en clinique pour le reste de l'étude et effectueront également des visites intermédiaires en clinique si l'enfant a la diarrhée. À chaque visite, l'enfant sera pesé, sa taille mesurée et des données anthropométriques prises, y compris le pli cutané pour la graisse corporelle sous-cutanée et la circonférence de la partie supérieure du bras. Lors de toute visite intermédiaire symptomatique, des évaluations seront faites de la gravité de la maladie (selon l'échelle de Vesikari) et un échantillon de selles sera prélevé pour la détermination de l'antigène et du génotype du rotavirus si le rotavirus est positif. Le patient sera également renvoyé chez lui avec un journal de la diarrhée à remplir au cours des deux semaines suivantes. Suite à l'identification d'un enfant atteint de gastro-entérite sévère, un témoin apparié selon l'âge de la cohorte (sans gastro-entérite récente) sera amené pour mesurer les taux de vitamine A et de zinc sérique. Les enfants atteints de gastro-entérite seront traités conformément aux directives nationales (selon la prise en charge intégrée des maladies infantiles de l'Organisation mondiale de la santé (OMS)). Si une référence est nécessaire, l'enfant sera référé à une clinique externe ou, dans les cas graves, à l'hôpital universitaire.

Procédures d'étude. Comme ci-dessus.

Méthodes de laboratoire.

1. La détection des IgA et IgG spécifiques du Rotavirus se fera par ELISA. La détection des IgA et IgG spécifiques du rotavirus se fera par ELISA. Brièvement, la procédure est la suivante. Les puits de la microplaque (par exemple, Nunc Immuno I) sont incubés avec des préparations d'antigènes viraux purifiés, puis lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate avec un détergent Tween (PBS-T). Les échantillons de sérum et de lait maternel sont dilués en série (dans du PBS-T contenant 1 % d'albumine de sérum bovin) et incubés dans les microplaques revêtues pendant 2 heures à 37 oC, puis une nuit à 4 oC. Les microplaques sont ensuite lavées et des anticorps de chèvre anti-IgA ou IgG humaines conjugués à la peroxydase (Sigma Immunochemicals) sont ajoutés. La réaction est ensuite terminée avec H2SO4, et la densité optique est mesurée par un lecteur de plaque EIA. Tous les échantillons sont dosés en double contre chaque antigène viral et contre un antigène témoin. Un puits de test a été considéré comme positif par sa densité optique à 450 nm, par exemple, s'il est supérieur ou égal à deux fois celui de son propre contrôle. La spécificité est contrôlée en incluant des puits contenant un antigène de contrôle incubé en l'absence de l'échantillon, et la sensibilité est vérifiée en incluant des puits contenant un antigène viral incubé en présence d'échantillons connus pour contenir un titre élevé d'une classe particulière d'immunoglobuline spécifique au rotavirus.
2. La détection de l'antigène de rotavirus se produira par Rotaclone ELISA. Les échantillons de selles seront testés pour le rotavirus par ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) selon les spécifications du fabricant. En bref, l'échantillon sera amené à température ambiante et dilué avec une solution saline tamponnée avec 0,02 % de thimérosol. L'échantillon dilué et le conjugué enzymatique sont ensuite incubés avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine VP6 dans la microplaque Rotaclone. Des tampons de substrat contenant du peroxyde d'urée et de la tétraméthylbenzidine sont ensuite ajoutés, et la réaction est terminée avec H2SO4. La détermination spectrophotométrique du résultat est ensuite effectuée en mesurant l'absorbance à 450 nm contre un blanc d'air. Les échantillons avec des unités d'absorbance (A450) supérieures à 0,150 sont considérés comme positifs. Ceux dont l'absorbance est égale ou inférieure à 0,150 sont considérés comme négatifs.

3 Détermination du génotype Rotavirus VP7. L'ARN viral est extrait d'une suspension à 10 % de matière fécale positive à l'antigène rotavirus dans du PBS (pH 7,0) à l'aide du réactif TRIzolTM (GIBCO Life Technologies) selon le protocole du fabricant. L'ARN viral est ensuite prélevé par RT-PCR comme décrit précédemment.

L'ARN viral extrait est ensuite prélevé par PCR nichée en utilisant des amorces qui sont complémentaires aux extrémités 3' des deux brins d'ARN viral dans le segment de gène 9, qui code pour la protéine virale 7 (VP7). Ces amorces sont utilisées pour la synthèse du premier brin. Amorce RVG9 ​​et six amorces spécifiques au sérotype (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 et aFT9) qui sont situées dans six régions variables sur le gène 9 et correspondent aux sérotypes G 1, 2, 3, 4, 8 et 9 , sont utilisés en seconde amplification. En bref, 5 µl d'ARN avec 25 pmol de chaque amorce Beg9 et End9 sont dénaturés pendant 5 min à 97°C et refroidis sur de la glace. Ensuite, 8 µl de mélange réactionnel RT contenant 1,5 µl de tampon PCR 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl de 25 mM MgCl2, 2 µl de 2,5 mM de chaque dATP, dCTP, dGTP et Le dTTP, 10 U de transcriptase inverse AMV (Promega) et 20 U d'inhibiteur de ribonucléase Rnasin (Promega) sont ajoutés au mélange échantillon-amorce et incubés à 42°C pendant 60 min. Mélange de tampon PCR (35 µl), contenant 3,5 µl de tampon PCR 10X, 2 µl de 2,5 mM de pêche dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 2,5 U AmpliTaq ADN polymérase (Perkin Elmer) et 27 µl d'eau sont ajoutés à la réaction RT. Le mélange réactionnel est dénaturé à 94°C pendant 3 min, suivi de 30 cycles (1 min à 94°C, 2 min à 42°C, 3 min à 72°C) et une extension finale de 5 min à 72°C .

Les produits de PCR de premier tour (2 µl) sont transférés dans 48 µl de deuxième mélange de réaction PCR, contenant 5 µl de tampon PCR 10X, 25 pmol chacun des amorces aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 et RVG9, 0,2 mM chacun dATP , dGTP, dCTP et dTTP, MgCl2 2 mM, 2,5 U de polymérase Taq. Les conditions de cyclisme du deuxième tour sont identiques à celles du premier tour, sauf que seuls 25 cycles sont exécutés. Les produits de PCR sont analysés par électrophorèse sur gel pour identifier les longueurs attendues de VP7 amplifié, permettant la détermination du génotype. D'autres ensembles d'amorces, conditions de PCR et/ou séquençage sont utilisés pour distinguer le génotype quand/si les amorces initiales échouent.

4 Détermination du génotype VP4. La stratégie de typage PCR du gène 4 est identique, en principe, à celle utilisée pour VP7.64 La synthèse du premier brin (transcription inverse) tire parti des zones hautement conservées de VP4 en utilisant les amorces Con2 et Con3 (Encadré 3), qui sont complémentaires à les extrémités 3' des deux brins d'ARN viral dans le segment de gène 4. 1 à 5 µL d'ARN viral sont ajoutés à des tubes de microcentrifugeuse de 0,5 ml contenant 3,5 µl de diméthylsulfoxyde (Sigma) dans un volume final de 8,5 µl, et les échantillons sont mélangés et dénaturé à 97°C pendant 5 min. Les échantillons sont ensuite refroidis sur de la glace pendant 5 min et recueillis par une brève centrifugation. 13,5 µL de H2O, 16 µL de désoxynucléosides triphosphates (1,25 mM chacun dATP, dGTP, dCTP et dTTP), 5 µL de tampon 1OX (100 mM Tris-chlorhydrate [pH 8,3], 500 mM KCl) (Perkin-Elmer Cetus), 3,5 µL de 25 mM MgCl2, 2 µl d'amorce (contenant 25 µM de chaque amorce, Con 2 et Con 3) et 9 U de transcriptase inverse sont ensuite ajoutés à chaque tube d'échantillon d'ARNdb dénaturé (pour donner un volume de réaction final de 49 µ1 ) et incubé à 42oC pendant 60 minutes.

Après l'ajout de 1 µL (1,9U) de polymérase Taq et de 100 µL d'huile minérale, la PCR de premier cycle est effectuée pendant 30 cycles (1 min à 94 oC, 2 min à 50 oC et 2 min à 72 oC. Un cycle de refroidissement est utilisé pour amener les échantillons à 17°C à la fin de l'expérience. La réaction de typage de deuxième cycle, si elle est effectuée en utilisant 0,5 à 5 µL du produit de premier cycle (5 µL si aucun produit visible ; 0,5 µL si produit visible) est mélangée avec 45 µL de mélange réactionnel dans un volume final de 50 µL. Si moins de 5 µL de produit de premier cycle sont ajoutés, le volume restant, pour compléter 50 µL, est de 10 mM de TrisHCl (pH 8,3) - 2,5 mM MgCl¬2. Le mélange réactionnel est composé de 19,5 μL ​​d'eau, 16 μL de dNTP, 5 μL de tampon II 10X, 3 μL de MgCl2 25 mM, 1 μL du cocktail d'amorces (contenant 20 μM de Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, et 4T-1) et 0,5 µL (2,5U) Taq. Les échantillons sont recouverts d'huile minérale et soumis à 25 cycles de PCR (mêmes cycles que le premier cycle). Les échantillons sont ensuite analysés par électrophorèse sur gel et la taille du produit permet la détermination du génotype VP4. D'autres ensembles d'amorces et/ou séquençage sont utilisés pour distinguer le génotype quand/si les amorces initiales échouent.

5 Détermination des niveaux de vitamine A et de zinc : les échantillons de sérum seront évalués pour le niveau de vitamine A par ELISA (par exemple, vitamine A humaine, EIAAB) conformément aux instructions du fabricant. En bref, la plaque de microtitration fournie dans ce kit a été pré-enduite d'un anticorps spécifique à la vitamine A. Des étalons ou des échantillons sont ensuite ajoutés aux puits appropriés de la plaque de microtitration avec une préparation d'anticorps polyclonaux conjugués à la biotine spécifiques de la VA et de l'avidine conjuguée au raifort La peroxydase (HRP) est ajoutée à chaque puits de la microplaque et incubée. Ensuite, une solution de substrat de tétraméthylbenzidine est ajoutée à chaque puits. Seuls les puits contenant de la vitamine A, un anticorps conjugué à la biotine et de l'avidine conjuguée à une enzyme présenteront un changement de couleur. La réaction enzyme-substrat est terminée par l'ajout d'un H2SO4 et le changement de couleur est mesuré par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 450 nm. La concentration de VA dans les échantillons est ensuite déterminée en comparant la D.O. des échantillons à la courbe standard.

Les niveaux de zinc seront mesurés à partir du sang à l'aide de dosages tels que la méthode colorimétrique simple de Lampugnani qui utilise une méthode spectrophotométrique avec le sel de sodium du chromogène 4-(2-pyridylazo) résorcinol pour mesurer les concentrations sériques de zinc.