Oorzaken van het falen van het Rotavirus-vaccin bij Zambiaanse kinderen

De studie zal worden uitgevoerd in de gezondheidsfaciliteit van Kamwala in Lusaka, waar de klinieken voor Maternal Child Health (MCH) en antiretrovirale therapie (ART) en de Kamwala Research Unit van het Center for Infectious Disease Research Zambia (CIDRZ) samen zijn gevestigd. Kamwala heeft een verzorgingsgebied van meer dan 10.000 met ongeveer 30 nieuwe baby's die elke maand bij MCH worden gepresenteerd met 6-14 weken (DPT-HiB-Hep) immunisatiepercentages van meer dan 95%. Moeder-kind-paren zullen tijdens het eerste bezoek aan MCH worden benaderd door de onderzoekskliniekassistent of peer-counselor met informatie over dit onderzoek in de lokale taal van hun keuze. Geïnteresseerden worden uitgenodigd in de onderzoekskliniek in de buurt, voor meer gedetailleerde informatie, waarbij gemotiveerde moeders worden geworven en door de onderzoeksverpleegkundige door het schriftelijke geïnformeerde toestemmingsproces worden geleid. Voor ongeletterde deelnemers zal een onafhankelijke, geletterde persoon getuige zijn van het proces van geïnformeerde toestemming en dit valideren. Er zal een specifiek logboek worden bijgehouden met informatie over data en aantallen van degenen die zijn uitgenodigd voor het onderzoek, en de redenen voor weigering zijn gedocumenteerd.

Een senior onderzoeksverpleegkundige, studieverpleegkundige en klinisch onderzoeksassistent zijn verantwoordelijk voor geïnformeerde toestemming en inschrijvingsprocedures onder supervisie van de onderzoeker. Indien nodig zal een kinderarts beschikbaar zijn voor hands-on consultatie.

Cohort-opvolging. Ingeschreven moeders zullen worden gevraagd om demografische en gedragsvragenlijsten in te vullen, een formulier voor het lokaliseren van deelnemers, en flebotomie en mechanische expressie van moedermelk te ondergaan tijdens het inschrijvingsbezoek voor bepaling van anti-rotavirus IgG en IgA (in serum en moedermelk). Bij baby's wordt een basislijn anti-rotavirus IgA en IgG-antilichamen bepaald om de basislijnblootstelling aan wild-type en transplacentaal immunoglobuline vast te stellen, gevolgd door een tweede serum-IgA-bepaling een maand na voltooiing van de rotavirusvaccinatie (na ongeveer 14-20 weken).

De baby's zullen dan gedurende de rest van het onderzoek elk kwartaal in de kliniek worden gevolgd en zullen ook tussentijdse kliniekbezoeken afleggen als het kind diarree heeft. Bij elk bezoek wordt het kind gewogen, de lengte gemeten en antropometrische metingen uitgevoerd, inclusief huidplooi voor onderhuids lichaamsvet en middenbovenarmomtrek. Tijdens elk symptomatisch tussentijds bezoek zal de ernst van de ziekte worden beoordeeld (aan de hand van de Vesikari-schaal) en zal er een ontlastingsmonster worden genomen om het rotavirusantigeen en het genotype te bepalen als het rotavirus positief is. De patiënt zal ook naar huis worden gestuurd met een diarreedagboek dat de volgende twee weken moet worden ingevuld. Na identificatie van een kind met ernstige gastro-enteritis, zal een op leeftijd afgestemde controle van binnen het cohort (zonder recente gastro-enteritis) worden ingeschakeld voor meting van vitamine A en serumzinkspiegels. Kinderen met gastro-enteritis zullen worden behandeld volgens de nationale richtlijnen (volgens World Health Organization (WHO) Integrated Management of Childhood Illness). Als verwijzing nodig is, wordt het kind verwezen naar de polikliniek of in ernstige gevallen naar het Academisch Ziekenhuis.

Studie Procedures. Hetzelfde als hierboven.

Laboratoriummethoden.

1. Detectie van Rotavirus-specifiek IgA en IgG zal plaatsvinden door middel van ELISA. Detectie van rotavirus-specifiek IgA en IgG zal plaatsvinden door middel van ELISA. In het kort is de procedure als volgt. Microplaatputjes (bijv. Nunc Immuno I) worden geïncubeerd met gezuiverde virale antigeenpreparaten, vervolgens gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween-detergens (PBS-T). Serum- en moedermelkmonsters worden serieel verdund (in PBS-T met 1% runderserumalbumine) en gedurende 2 uur bij 37°C en vervolgens een nacht bij 4°C in de gecoate microtiterplaten geïncubeerd. Microtiterplaten worden vervolgens gewassen en aan peroxidase geconjugeerde anti-menselijke IgA- of IgG-geit-antilichamen (Sigma Immunochemicals) worden toegevoegd. De reactie wordt vervolgens beëindigd met H2SO4 en de optische dichtheid wordt gemeten met een EIA-plaatlezer. Alle monsters worden in tweevoud getest tegen elk viraal antigeen en tegen een controleantigeen. Een testputje werd als positief beschouwd door zijn optische dichtheid bij 450 nm, bijvoorbeeld als deze groter is dan of gelijk is aan tweemaal die van zijn eigen controle. De specificiteit wordt gecontroleerd door putjes op te nemen die controleantigeen bevatten die zijn geïncubeerd in afwezigheid van het monster, en de gevoeligheid wordt gecontroleerd door putjes op te nemen die viraal antigeen bevatten dat is geïncubeerd in aanwezigheid van monsters waarvan bekend is dat ze een hoge titer van een bepaalde rotavirusspecifieke immunoglobulineklasse bevatten.
2. Detectie van Rotavirus Antigeen zal plaatsvinden door middel van Rotaclone ELISA. Ontlastingsmonsters zullen worden getest op rotavirus door ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) volgens de specificaties van de fabrikant. In het kort wordt het monster op kamertemperatuur gebracht en verdund met gebufferde zoutoplossing met 0,02% thimerosol. Verdund monster en enzymconjugaat worden vervolgens geïncubeerd met een monoklonaal antilichaam tegen het VP6-eiwit in de Rotaclone-microtiterplaat. Substraatbuffers die ureumperoxide en tetramethylbenzidine bevatten, worden vervolgens toegevoegd en de reactie wordt beëindigd met H2SO4. Vervolgens wordt het resultaat spectrofotometrisch bepaald door de absorptie bij 450 nm te meten tegen een luchtblanco. Specimens met absorptie-eenheden (A450) groter dan 0,150 worden als positief beschouwd. Degenen met een absorptie gelijk aan of lager dan 0,150 worden als negatief beschouwd.

3 Bepaling van het Rotavirus VP7 Genotype. Viraal RNA wordt geëxtraheerd uit een 10% suspensie van rotavirus-antigeen-positief fecaal materiaal in PBS (pH 7,0) met behulp van TRIzolTM-reagens (GIBCO Life Technologies) volgens het protocol van de fabrikant. Viraal RNA wordt vervolgens via RT-PCR genomen, zoals eerder beschreven.

Geëxtraheerd viraal RNA wordt vervolgens door geneste PCR gehaald met behulp van primers die complementair zijn aan de 3'-uiteinden van beide virale RNA-strengen binnen gensegment 9, dat codeert voor viraal eiwit 7 (VP7). Deze primers worden gebruikt voor de synthese van de eerste streng. Primer RVG9 ​​en zes serotypespecifieke primers (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 en aFT9) die zich in zes variabele regio's op gen 9 bevinden en overeenkomen met G-serotypen 1, 2, 3, 4, 8 en 9 , worden gebruikt in tweede versterking. In het kort wordt 5 µl RNA met 25 pmol van elke primer Beg9 en End9 gedurende 5 minuten bij 97°C gedenatureerd en op ijs gekoeld. Daarna werd 8 µl RT-reactiemengsel met 1,5 µl 10X PCR-buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mM van elke dATP, dCTP, dGTP en dTTP, 10 U AMV reverse transcriptase (Promega) en 20 U Rnasin-ribonucleaseremmer (Promega) wordt aan het monster-primermengsel toegevoegd en gedurende 60 minuten bij 42°C geïncubeerd. PCR-buffermengsel (35 µl), dat 3,5 µl 10X PCR-buffer, 2 µl 2,5 mM peach dATP, dCTP, dGTP en dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA-polymerase (Perkin Elmer) en 27 µl water bevat, wordt aan de RT-reactie toegevoegd. Het reactiemengsel wordt 3 min bij 94°C gedenatureerd, gevolgd door 30 cycli (1 min bij 94°C, 2 min bij 42°C, 3 min bij 72°C) en een laatste verlenging van 5 min bij 72°C .

PCR-producten van de eerste ronde (2 µl) worden overgebracht naar 48 µl tweede PCR-reactiemengsel, dat 5 µl 10X PCR-buffer bevat, elk 25 pmol primers aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 en RVG9, elk 0,2 mM dATP , dGTP, dCTP en dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U Taq-polymerase. De fietsomstandigheden in de tweede ronde zijn identiek aan de eerste ronde, behalve dat er slechts 25 cycli worden gereden. De PCR-producten worden geanalyseerd door middel van gelelektroforese om de verwachte lengte van geamplificeerd VP7 te identificeren, waardoor het genotype kan worden bepaald. Andere primersets, PCR-omstandigheden en/of sequencing worden gebruikt om het genotype te onderscheiden wanneer/als de initiële primers falen.

4 Bepaling van het VP4-genotype. De strategie voor PCR-typering van gen 4 is in principe identiek aan die gebruikt voor VP7.64 Eerste strengsynthese (reverse transcriptie) maakt gebruik van sterk geconserveerde gebieden van VP4 met behulp van primers Con2 en Con3 (kader 3), die complementair zijn aan de 3'-uiteinden van beide virale RNA-strengen binnen gensegment 4. 1 tot 5 µl viraal RNA wordt toegevoegd aan microcentrifugebuisjes van 0,5 ml die 3,5 µl dimethylsulfoxide (Sigma) bevatten in een eindvolume van 8,5 µl, en de monsters worden gemengd en gedenatureerd bij 97°C gedurende 5 min. De monsters worden vervolgens 5 minuten op ijs gekoeld en door kort centrifugeren verzameld. 13,5 μL H20, 16 μL deoxynucleoside-trifosfaten (1,25 mM elk dATP, dGTP, dCTP en dTTP), 5 μL 1OX-buffer (100 mM Tris-hydrochloride [pH 8,3], 500 mM KCl) (Perkin-Elmer Cetus), 3,5 µl 25 mM MgCl2, 2 µl primer (met 25 µM van elke primer, Con 2 en Con 3), en 9 U reverse transcriptase wordt vervolgens toegevoegd aan elk gedenatureerd dsRNA-monsterbuisje (om een ​​uiteindelijk reactievolume van 49 µ1 ) en gedurende 60 minuten bij 42oC geïncubeerd.

Na toevoeging van 1 µl (1,9 U) Taq-polymerase en 100 µl minerale olie wordt de eerste ronde PCR uitgevoerd gedurende 30 cycli (1 min. 94°C, 2 min. bij 50°C en 2 min. bij 72°C. Een koelcyclus wordt gebruikt om de monsters op 17°C te brengen aan het einde van het experiment. De typereactie van de tweede ronde, indien uitgevoerd met 0,5 tot 5 µL van het product van de eerste ronde (5 µL indien geen zichtbaar product; 0,5 µL indien zichtbaar product) wordt gemengd met 45 µL reactiemengsel in een eindvolume van 50 µL. Als er minder dan 5 µL van het eerste ronde product wordt toegevoegd, is het resterende volume, om 50 µL te voltooien, 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM MgCl¬2. Het reactiemengsel is 19,5 µL water, 16 µL dNTP's, 5 µL 10X Buffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL van de primercocktail (met elk 20 µM van Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, en 4T-1), en 0,5 µl (2,5 U) Taq. De monsters worden bedekt met minerale olie en ondergaan 25 PCR-ronden (dezelfde cycli als de eerste ronde). De monsters worden vervolgens geanalyseerd door middel van gelelektroforese en de productgrootte maakt bepaling van het VP4-genotype mogelijk. Andere primersets en/of sequencing worden gebruikt om het genotype te onderscheiden wanneer/als de initiële primers falen.

5 Bepaling van vitamine A- en zinkgehaltes: Serummonsters worden beoordeeld op vitamine A-gehalte door middel van ELISA (bijv. Humane vitamine A, EIAAB) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort, de microtiterplaat in deze kit is vooraf gecoat met een antilichaam dat specifiek is voor vitamine A. Standaarden of monsters worden vervolgens toegevoegd aan de juiste microtiterplaatwells met een biotine-geconjugeerd polyklonaal antilichaampreparaat dat specifiek is voor VA en Avidine geconjugeerd aan mierikswortel. Peroxidase (HRP) wordt aan elk putje van de microtiterplaat toegevoegd en geïncubeerd. Vervolgens wordt aan elk putje een tetramethylbenzidine-substraatoplossing toegevoegd. Alleen die putjes die vitamine A, biotine-geconjugeerd antilichaam en enzym-geconjugeerd Avidine bevatten, zullen een kleurverandering vertonen. De enzym-substraatreactie wordt beëindigd door toevoeging van een H2SO4 en de kleurverandering wordt spectrofotometrisch gemeten bij een golflengte van 450 nm. De concentratie van VA in de monsters wordt vervolgens bepaald door de O.D. van de monsters naar de standaardkromme.

Zinkgehalten zullen worden gemeten uit het bloed met behulp van assays zoals de eenvoudige colorimetrische methode van Lampugnani, die een spectrofotometrische methode gebruikt met chromogeen 4-(2-pyridylazo) resorcinol-natriumzout om serumzinkconcentraties te meten.