Příčiny selhání vakcíny proti rotavirům u zambijských dětí

Studie bude provedena ve zdravotnickém zařízení Kamwala v Lusace, kde sídlí kliniky pro zdraví matek (MCH) a antiretrovirová terapie (ART) a také Centrum pro výzkum infekčních chorob Zambie (CIDRZ) Kamwala Research Unit. Kamwala má spádovou populaci více než 10 000, přičemž přibližně 30 nových kojenců přichází na MCH každý měsíc s 6-14týdenní (DPT-HiB-Hep) mírou imunizace nad 95 %. Na páry matka-dítě se během úvodní návštěvy MCH obrátí asistent studijní kliniky nebo peer poradce s informacemi o této studii v místním zvoleném jazyce. Všeobecní zájemci budou pozváni do výzkumné kliniky, která je poblíž, pro podrobnější informace, během kterých budou motivované matky náborovány a probírány písemným informovaným souhlasem studijní sestry. U negramotných účastníků bude nezávislý, gramotný jedinec svědkem a ověří proces informovaného souhlasu. Bude veden zvláštní protokol, který bude obsahovat informace o datech a počtu osob pozvaných do studie, zdokumentované důvody odmítnutí.

Vedoucí výzkumná sestra, studijní sestra a asistent klinického výzkumu budou zodpovědní za informovaný souhlas a procedury zápisu pod dohledem zkoušejícího. V případě potřeby bude k dispozici pediatr pro praktické konzultace.

Sledování kohorty. Zapsané matky budou požádány, aby vyplnily demografické a behaviorální dotazníky, formulář pro vyhledání účastníků a podstoupily flebotomii a mechanickou expresi mateřského mléka při návštěvě za účelem stanovení antirotavirových IgG a IgA (v séru a mateřském mléce). U kojenců budou stanoveny základní hodnoty anti-rotavirových IgA a IgG protilátek, aby se zjistila výchozí expozice divokému typu a transplacentárnímu imunoglobulinu, následovaná druhým stanovením sérového IgA jeden měsíc po dokončení rotavirové vakcinace (přibližně 14-20 týdnů).

Kojenci budou poté čtvrtletně sledováni na klinice po zbytek studie a budou také provádět dočasné návštěvy kliniky, pokud má dítě průjem. Při každé návštěvě bude dítě zváženo, změřena výška a antropometrie, včetně kožní řasy pro zjištění podkožního tělesného tuku a obvodu střední části paže. Během jakékoli prozatímní symptomatické návštěvy bude provedena hodnocení závažnosti onemocnění (pomocí Vesikariho stupnice) a bude odebrán vzorek stolice pro stanovení rotavirového antigenu a genotypu, pokud je rotavirus pozitivní. Pacient bude také poslán domů s deníkem průjmu, který bude vyplněn během následujících dvou týdnů. Po identifikaci dítěte s těžkou gastroenteritidou bude zařazena věkově odpovídající kontrola z kohorty (bez nedávné gastroenteritidy) pro měření hladiny vitaminu A a sérového zinku. Děti s gastroenteritidou budou léčeny podle národních směrnic (podle Světové zdravotnické organizace (WHO) Integrovaný management dětských nemocí). V případě nutnosti doporučení bude dítě odesláno do ambulance, v závažných případech do Fakultní nemocnice.

Studijní postupy. Stejné jako výše.

Laboratorní metody.

1. Detekce IgA a IgG specifických pro rotavirus proběhne pomocí ELISA. Detekce IgA a IgG specifických pro rotavirus bude probíhat pomocí ELISA. Stručně řečeno, postup je následující. Jamky mikrodestičky (např. Nunc Immuno I) se inkubují s purifikovanými virovými antigenními přípravky, poté se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem s detergentem Tween (PBS-T). Vzorky séra a mateřského mléka se sériově naředí (v PBS-T obsahujícím 1 % hovězího sérového albuminu) a inkubují se v potažených mikrotitračních destičkách po dobu 2 hodin při 37 °C a poté přes noc při 4 °C. Mikrodestičky se poté promyjí a přidají se kozí protilátky proti lidskému IgA nebo IgG konjugované s peroxidázou (Sigma Immunochemicals). Reakce se poté ukončí H2S04 a optická hustota se změří čtečkou destiček EIA. Všechny vzorky jsou testovány v duplikátech proti každému virovému antigenu a proti kontrolnímu antigenu. Testovaná jamka byla považována za pozitivní svou optickou hustotou při 450 nm, např. pokud je větší nebo rovna dvojnásobku její vlastní kontroly. Specificita je kontrolována zahrnutím jamek obsahujících kontrolní antigen inkubovaných v nepřítomnosti vzorku a citlivost je kontrolována zahrnutím jamek obsahujících virový antigen inkubovaných v přítomnosti vzorků, o kterých je známo, že obsahují vysoký titr konkrétní třídy imunoglobulinů specifických pro rotavirus.
2. Detekce rotavirového antigenu bude provedena pomocí Rotaclone ELISA. Vzorky stolice budou testovány na rotavirus metodou ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) podle specifikací výrobce. Stručně, vzorek se přivede na pokojovou teplotu a zředí se pufrovaným fyziologickým roztokem s 0,02% thimerosolem. Zředěný vzorek a enzymový konjugát se poté inkubují s monoklonální protilátkou proti proteinu VP6 na mikrodestičky Rotaclone. Poté se přidají substrátové pufry obsahující peroxid močoviny a tetramethylbenzidin a reakce se ukončí H2SO4. Spektrofotometrické stanovení výsledku se pak provede měřením absorbance při 450 nm proti vzduchovému slepému pokusu. Vzorky s jednotkami absorbance (A450) většími než 0,150 jsou považovány za pozitivní. Ty s absorbancí rovnou nebo nižší než 0,150 jsou považovány za negativní.

3 Stanovení genotypu rotaviru VP7. Virová RNA je extrahována z 10% suspenze rotavirového antigen-pozitivního fekálního materiálu v PBS (pH 7,0) pomocí TRIzolTM Reagent (GIBCO Life Technologies) podle protokolu výrobce. Virová RNA je poté odebrána pomocí RT-PCR, jak bylo popsáno dříve.

Extrahovaná virová RNA je poté odebrána prostřednictvím nested PCR s využitím primerů, které jsou komplementární k 3' koncům obou vláken virové RNA v genovém segmentu 9, který kóduje virový protein 7 (VP7). Tyto primery se používají pro syntézu prvního vlákna. Primer RVG9 ​​a šest sérotypově specifických primerů (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 a aFT9), které se nacházejí v šesti variabilních oblastech genu 9 a odpovídají G-sérotypům 1, 2, 3, 4, 8 a 9 , se používají ve druhém zesílení. Stručně, 5 ul RNA s 25 pmol každého primeru Beg9 a End9 se denaturuje po dobu 5 minut při 97 °C a ochladí se na ledu. Poté bylo přidáno 8 ul RT reakční směsi obsahující 1,5 ul 10X PCR pufru (500 mM KCI, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 ul 25 mM MgCl2, 2 ul 2,5 mM každého dATP, dGd dTTP, 10 U AMV reverzní transkriptázy (Promega) a 20 U inhibitoru ribonukleázy Rnasin (Promega) se přidá ke směsi vzorek-primer a inkubuje se při 42 °C po dobu 60 minut. Směs PCR pufru (35 ul), obsahující 3,5 ul 10X PCR pufru, 2 ul 2,5 mM broskvového dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer) a 27 ul vody se přidaly do RT reakce. Reakční směs se denaturuje při 94 °C po dobu 3 minut, následuje 30 cyklů (1 minuta při 94 °C, 2 minuty při 42 °C, 3 minuty při 72 °C) a konečné prodloužení 5 minut při 72 °C .

Produkty PCR prvního kola (2 ul) se přenesou do 48 ul druhé reakční směsi PCR obsahující 5 ul 10X PCR pufru, 25 pmol každého primeru aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 a RVG9, 0,2 mM každého dATP dGTP, dCTP a dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U Taq polymerázy. Podmínky pro druhé kolo jsou stejné jako pro první kolo s tím rozdílem, že se jede pouze 25 cyklů. Produkty PCR jsou analyzovány gelovou elektroforézou k identifikaci očekávaných délek amplifikovaných VP7, což umožňuje stanovení genotypu. Jiné sady primerů, podmínky PCR a/nebo sekvenování se používají k rozlišení genotypu, když/pokud počáteční primery selžou.

4 Stanovení genotypu VP4. Strategie pro PCR typizaci genu 4 je v principu identická se strategií používanou pro VP7.64 Syntéza prvního vlákna (reverzní transkripce) využívá vysoce konzervované oblasti VP4 s využitím primerů Con2 a Con3 (rámeček 3), které jsou komplementární k 3' konce obou virových RNA řetězců v genovém segmentu 4. 1 až 5 ul virové RNA se přidá do 0,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 3,5 ul dimethylsulfoxidu (Sigma) v konečném objemu 8,5 ul a vzorky se smíchají a denaturována při 97 °C po dobu 5 minut. Vzorky se poté ochladí na ledu po dobu 5 minut a shromáždí se krátkou centrifugací. 13,5 ul H20, 16 ul deoxynukleosidtrifosfátů (1,25 mM každý dATP, dGTP, dCTP a dTTP), 5 ul 1OX pufru (100 mM Tris-hydrochlorid [pH 8,3], 500 mM Cemerkin KtusCl) (Perkin-Cl) 3,5 µl 25 mM MgCl2, 2 µl primeru (obsahujícího 25 µM každého primeru, Con 2 a Con 3) a 9 U reverzní transkriptázy se poté přidá do každé zkumavky se vzorkem denaturované dsRNA (k získání konečného reakčního objemu 49 ul ) a inkubovány při 42 °C po dobu 60 minut.

Po přidání 1 ul (1,9 U) Taq polymerázy a 100 ul minerálního oleje se první kolo PCR provádí ve 30 cyklech (1 min 94 °C, 2 min při 50 °C a 2 min při 72 °C. K uvedení vzorků na 17 °C po dokončení experimentu se použije chladicí cyklus. Typizační reakce druhého kola, pokud se provádí s použitím 0,5 až 5 ul produktu z prvního kola (5 ul, pokud není viditelný produkt; 0,5 ul, pokud není viditelný produkt), se smíchá s 45 ul reakční směsi v konečném objemu 50 ul. Pokud se přidá méně než 5 ul produktu z prvního kola, zbývající objem k dokončení 50 ul je 10 mM TrisHCl (pH 8,3) - 2,5 mM MgCl¬2. Reakční směs je 19,5 ul vody, 16 ul dNTP, 5 ul 10X pufru II, 3 ul 25 mM MgCl2, 1 ul koktejlu primerů (obsahující 20 uM každého z Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, a 4T-1) a 0,5 ul (2,5 U) Taq. Vzorky se překryjí minerálním olejem a odeberou se 25 cykly PCR (stejné cykly jako první kolo). Vzorky jsou poté analyzovány gelovou elektroforézou a velikost produktu umožňuje stanovení genotypu VP4. Jiné sady primerů a/nebo sekvenování se používají k rozlišení genotypu, když/pokud počáteční primery selžou.

5 Stanovení hladin vitaminu A a zinku: Vzorky séra budou hodnoceny na hladinu vitaminu A pomocí ELISA (např. lidský vitamin A, EIAAB) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, mikrotitrační destička poskytnutá v této soupravě byla předem potažena protilátkou specifickou pro vitamín A. Standardy nebo vzorky jsou poté přidány do příslušných jamek mikrotitrační destičky s biotinem konjugovaným přípravkem polyklonální protilátky specifické pro VA a Avidin konjugovaný s křenem Do každé jamky mikrodestičky se přidá peroxidáza (HRP) a inkubuje se. Poté se do každé jamky přidá roztok substrátu tetramethylbenzidinu. Změnu barvy budou vykazovat pouze ty jamky, které obsahují vitamín A, protilátku konjugovanou s biotinem a avidin konjugovaný s enzymem. Reakce enzym-substrát se ukončí přidáním H2SO4 a změna barvy se měří spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Koncentrace VA ve vzorcích se pak stanoví porovnáním O.D. vzorků ke standardní křivce.

Hladiny zinku budou měřeny z krve pomocí testů, jako je jednoduchá kolorimetrická metoda Lampugnani, která využívá spektrofotometrickou metodu se sodnou solí chromogenu 4-(2-pyridylazo)resorcinolu k měření koncentrací zinku v séru.