Orsaker till rotavirusvaccinfel hos zambiska barn

Studien kommer att genomföras på Kamwala hälsoinrättning i Lusaka där klinikerna för mödrar barns hälsa (MCH) och antiretroviral terapi (ART) samt centret för forskning om infektionssjukdomar Zambia (CIDRZ) Kamwala forskningsenhet är samlokaliserade. Kamwala har en upptagningsbefolkning på över 10 000 med cirka 30 nya spädbarn som presenterar sig för MCH varje månad med 6-14 veckors (DPT-HiB-Hep) immuniseringsfrekvenser över 95 %. Mamma-spädbarnspar kommer att kontaktas under det första besöket på MCH av studieklinikassistenten eller kamratrådgivaren med information om denna studie på det lokala språket. De allmänt intresserade kommer att bjudas in till forskningskliniken som ligger i närheten, för mer detaljerad information under vilken motiverade mammor kommer att rekryteras och tas genom den skriftliga informerade samtyckesprocessen av studiesköterskan. För analfabeter kommer en oberoende, läskunnig individ att bevittna och validera processen för informerat samtycke. En specifik logg kommer att föras för att visa information om datum och antal för de inbjudna till studien, skäl för avslag dokumenterade.

En senior forskningssköterska, studiesköterska och klinisk forskningsassistent kommer att ansvara för informerat samtycke och registreringsprocedurer under överinseende av utredaren. En barnläkare kommer att finnas tillgänglig för praktisk konsultation vid behov.

Kohortuppföljning. Inskrivna mödrar kommer att bli ombedda att fylla i demografiska och beteendemässiga frågeformulär, ett formulär för att hitta deltagare, och genomgå flebotomi och mekanisk expression av bröstmjölk vid inskrivningsbesöket för bestämning av anti-rotavirus IgG och IgA (i serum och bröstmjölk). Spädbarn kommer att ha en baslinje anti-rotavirus IgA och IgG antikroppar som fastställs för att fastställa baseline exponering för vildtyp och transplacental immunglobulin följt av en andra serum IgA bestämning en månad efter avslutad rotavirus vaccination (vid ungefär 14-20 veckor).

Spädbarn kommer sedan att följas kvartalsvis på kliniken under resten av studien och kommer också att göra interimistiska klinikbesök om barnet har diarré. Vid varje besök kommer barnet att vägas, längden mätas och antropometri tas, inklusive hudveck för subkutant kroppsfett och mitten av överarmens omkrets. Under eventuella symtomatiska interimsbesök kommer bedömningar att göras av sjukdomens svårighetsgrad (enligt Vesikari-skalan) och ett prov av avföring kommer att samlas in för bestämning av rotavirusantigen och genotyp om rotavirus är positivt. Patienten kommer också att skickas hem med en diarrédagbok som ska fyllas i under de följande två veckorna. Efter identifiering av ett barn med svår gastroenterit kommer en åldersmatchad kontroll inifrån kohorten (utan nyligen genomförd gastroenterit) att tas in för mätning av vitamin A och serumzinknivåer. Barn med gastroenterit kommer att behandlas enligt nationella riktlinjer (enligt Världshälsoorganisationens (WHO) Integrated Management of Childhood Illness). Om remiss krävs remitteras barnet till öppenvårdsmottagning, eller i allvarliga fall till Universitetssjukhuset.

Studieprocedurer. Samma som ovan.

Laboratoriemetoder.

1. Detektion av rotavirusspecifik IgA och IgG kommer att ske med ELISA. Detektion av rotavirusspecifik IgA och IgG kommer att ske med ELISA. I korthet är proceduren som följer. Mikroplattbrunnar (t.ex. Nunc Immuno I) inkuberas med renade virala antigenberedningar, tvättas sedan med fosfatbuffrad saltlösning med Tween detergent (PBS-T). Serum- och bröstmjölksprover späds i serie (i PBS-T innehållande 1 % bovint serumalbumin) och inkuberas i de belagda mikroplattorna i 2 timmar vid 37oC och sedan över natten vid 4oC. Mikroplattor tvättas sedan och peroxidaskonjugerade anti-humana IgA- eller IgG-getantikroppar (Sigma Immunochemicals) tillsätts. Reaktionen avslutas sedan med H2SO4, och optisk densitet mäts med EIA-plattläsare. Alla prover analyseras i duplikat mot varje viralt antigen och mot ett kontrollantigen. En testbrunn ansågs positiv genom sin optiska densitet vid 450 nm, t.ex. om den är större än eller lika med två gånger den för dess egen kontroll. Specificiteten kontrolleras genom att inkludera brunnar som innehåller kontrollantigen inkuberat i frånvaro av provet, och känsligheten kontrolleras genom att inkludera brunnar som innehåller viralt antigen inkuberat i närvaro av prover som är kända för att innehålla hög titer av en viss rotavirusspecifik immunglobulinklass.
2. Detektion av rotavirusantigen kommer att ske med Rotaclon ELISA. Avföringsprover kommer att testas för rotavirus med ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) enligt tillverkarens specifikationer. Kortfattat kommer provet att bringas till rumstemperatur och spädas med buffrad saltlösning med 0,02 % timerosol. Utspätt prov och enzymkonjugat inkuberas sedan med en monoklonal antikropp mot VP6-proteinet i Rotaclon-mikroplattan. Substratbuffertar innehållande ureaperoxid och tetrametylbensidin tillsätts sedan och reaktionen avslutas med H2SO4. Spektrofotometrisk bestämning av resultatet görs sedan genom att mäta absorbansen vid 450 nm mot en luftblank. Prover med absorbansenheter (A450) större än 0,150 anses vara positiva. De med absorbans lika med eller under 0,150 anses vara negativa.

3 Bestämning av rotavirus VP7 genotyp. Viralt RNA extraheras från en 10 % suspension av rotavirusantigenpositivt fekalt material i PBS (pH 7,0) med hjälp av TRIzolTM Reagent (GIBCO Life Technologies) enligt tillverkarens protokoll. Viralt RNA tas sedan genom RT-PCR som beskrivits tidigare.

Extraherat viralt RNA tas sedan genom kapslad PCR med användning av primrar som är komplementära till 3'-ändarna av båda virala RNA-strängarna inom gensegment 9, som kodar för viralt protein 7 (VP7). Dessa primrar används för första strängsyntes. Primer RVG9 ​​och sex serotypspecifika primrar (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 och aFT9) som finns i sex variabla regioner på genen 9 och motsvarar G-serotyperna 1, 2, 3, 4, 8 och 9 , används i andra amplifiering. Kortfattat denatureras 5 µl RNA med 25 pmol av varje primer Beg9 och End9 under 5 minuter vid 97°C och kyls på is. Därefter, 8 µl RT-reaktionsblandning innehållande 1,5 µl 10X PCR-buffert (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mM av varje dATP, dCTP, dTP, dCTP och dCTP dTTP, 10 U AMV omvänt transkriptas (Promega) och 20 U Rnasin-ribonukleasinhibitor (Promega), tillsätts till prov-primerblandningen och inkuberas vid 42°C under 60 minuter. PCR-buffertblandning (35 µl), innehållande 3,5 µl 10X PCR-buffert, 2 µl 2,5 mM persika dATP, dCTP, dGTP och dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA-polymeras (Perkin Elmer) och 27 µl vatten tillsätts till RT-reaktionen. Reaktionsblandningen denatureras vid 94°C i 3 min, följt av 30 cykler (1 min vid 94°C, 2 min vid 42°C, 3 min vid 72°C) och en slutlig förlängning på 5 min vid 72°C .

Första omgångens PCR-produkter (2 µl) överförs till 48 µl andra PCR-reaktionsblandning, innehållande 5 µl 10X PCR-buffert, 25 pmol vardera primrarna aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 och RVG9, 0,2 mM varje dATP dGTP, dCTP och dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U Taq-polymeras. Cykelförhållandena i andra omgången är identiska med första omgången, förutom att endast 25 cykler körs. PCR-produkterna analyseras genom gelelektrofores för att identifiera förväntade längder av amplifierat VP7, vilket möjliggör bestämning av genotyp. Andra primeruppsättningar, PCR-förhållanden och/eller sekvensering används för att särskilja genotyp när/om de initiala primrarna misslyckas.

4 Bestämning av VP4 genotyp. Strategin för PCR-typning av gen 4 är i princip identisk med den som används för VP7.64 Första strängsyntes (omvänd transkription) drar fördel av mycket konserverade områden av VP4 som använder primrarna Con2 och Con3 (ruta 3), som är komplementära till 3'-ändarna av båda virala RNA-strängarna inom gensegment 4. 1 till 5 µL viralt RNA tillsätts till 0,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 3,5 µl dimetylsulfoxid (Sigma) i en slutlig volym på 8,5 µl, och proverna blandas och denaturerad vid 97°C under 5 min. Proverna kyls sedan på is under 5 minuter och samlas upp genom kort centrifugering. 13,5 µL H20, 16 µL deoxinukleosidtrifosfater (1,25 mM vardera dATP, dGTP, dCTP och dTTP), 5 µL 1OX-buffert (100 mM Tris-hydroklorid [pH 8,3], 500 mM KCl) 3,5 µL 25 mM MgCl2, 2 µl primer (innehållande 25 µM av varje primer, Con 2 och Con 3) och 9 U omvänt transkriptas tillsätts sedan till varje denaturerat dsRNA-provrör (för att ge en slutlig reaktionsvolym på 49 µ1 (Na2S04) och inkuberades vid 42°C i 60 minuter.

Efter tillsats av 1 µL (1,9 U) Taq-polymeras och 100 µL mineralolja, utförs första omgången PCR i 30 cykler (1 min 94oC, 2 min vid 50oC och 2 min vid 72oC. En kylcykel används för att få proverna till 17°C när experimentet är slutfört. Typningsreaktionen i andra omgången, om den utförs med 0,5 till 5 µL av produkten från första omgången (5 µL om ingen synlig produkt; 0,5 µL om produkten är synlig) blandas med 45 µL reaktionsblandning i en slutvolym på 50 µL. Om mindre än 5 µL av första omgångsprodukten tillsätts är den återstående volymen, för att slutföra 50 µL, 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM MgCl¬2. Reaktionsblandningen är 19,5 µL vatten, 16 µL dNTPs, 5 µL 10X Buffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL av primercocktailen (innehållande 20 µM vardera av Con3, 1T-1, 3T-1, 3T-1, 3T-1, och 4T-1), och 0,5 µL (2,5 U) Taq. Proverna överlagras med mineralolja och tas genom 25 omgångar av PCR (samma cykler som första omgången). Proverna analyseras sedan med gelelektrofores och produktstorleken möjliggör bestämning av VP4-genotyp. Andra primeruppsättningar och/eller sekvensering används för att särskilja genotyp när/om de initiala primrarna misslyckas.

5 Bestämning av vitamin A- och zinknivåer: Serumprover kommer att utvärderas för vitamin A-nivåer med ELISA (t.ex. Human Vitamin A, EIAAB) enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat har mikrotiterplattan som tillhandahålls i detta kit förbelagts med en antikropp specifik mot vitamin A. Standarder eller prover läggs sedan till lämpliga mikrotiterplattor med en biotinkonjugerad polyklonal antikroppspreparat specifik för VA och avidin konjugerad till pepparrot Peroxidas (HRP) tillsätts till varje mikroplattabrunn och inkuberas. Därefter tillsätts en tetrametylbensidinsubstratlösning till varje brunn. Endast de brunnar som innehåller vitamin A, biotinkonjugerad antikropp och enzymkonjugerad Avidin kommer att uppvisa en färgförändring. Enzym-substratreaktionen avslutas genom tillsats av en H2SO4 och färgförändringen mäts spektrofotometriskt vid en våglängd av 450 nm. Koncentrationen av VA i proverna bestäms sedan genom att jämföra O.D. av proverna till standardkurvan.

Zinknivåer kommer att mätas från blod med hjälp av analyser som Lampugnanis enkla kolorimetriska metod som använder en spektrofotometrisk metod med kromogen 4-(2-pyridylazo) resorcinolnatriumsalt för att mäta zinkkoncentrationer i serum.