Årsaker til rotavirusvaksinesvikt hos zambiske barn

Studien vil bli utført ved Kamwala helsefasilitet i Lusaka hvor klinikkene for mors barns helse (MCH) og antiretroviral terapi (ART) samt Senter for infeksjonsforskning Zambia (CIDRZ) Kamwala forskningsenhet er samlokalisert. Kamwala har en populasjon på over 10 000 med omtrent 30 nye spedbarn som presenteres for MCH hver måned med 6-14 ukers (DPT-HiB-Hep) immuniseringsrater over 95 %. Mor-spedbarnspar vil bli kontaktet under det første besøket til MCH av studieklinikkens assistent eller jevnaldrende rådgiver med informasjon om denne studien på det lokale valgspråket. De generelt interesserte vil bli invitert til forskningsklinikken som ligger i nærheten, for mer detaljert informasjon der motiverte mødre vil bli rekruttert og tatt gjennom den skriftlige informerte samtykkeprosessen av studiesykepleieren. For analfabeter vil en uavhengig, lesekyndig person være vitne til og validere prosessen med informert samtykke. En spesifikk logg vil bli opprettholdt for å vise informasjon om datoer og antall inviterte til studien, årsaker til avslag dokumentert.

En senior forskningssykepleier, studiesykepleier og klinisk forskningsassistent vil være ansvarlig for informert samtykke og påmeldingsprosedyrer under tilsyn av etterforskeren. En barnelege vil være tilgjengelig for praktisk konsultasjon ved behov.

Kohortoppfølging. Påmeldte mødre vil bli bedt om å fylle ut demografiske og atferdsmessige spørreskjemaer, et deltakerlokaliseringsskjema, og gjennomgå flebotomi og mekanisk ekspresjon av morsmelk ved påmeldingsbesøket for å bestemme anti-rotavirus IgG og IgA (i serum og morsmelk). Spedbarn vil ha en baseline anti-rotavirus IgA og IgG antistoffer bestemt for å fastslå baseline eksponering for villtype og transplacental immunglobulin etterfulgt av en andre serum IgA bestemmelse én måned etter fullført rotavirus vaksinasjon (ved ca. 14-20 uker).

Spedbarn vil deretter følges kvartalsvis i klinikken for resten av studien og vil også foreta midlertidige klinikkbesøk hvis barnet har diaré. Ved hvert besøk vil barnet bli veid, høydemålt og antropometrisk tatt, inkludert hudfold for subkutant kroppsfett og midt på overarmens omkrets. Under eventuelle symptomatiske midlertidige besøk vil det bli gjort vurderinger av sykdommens alvorlighetsgrad (ved Vesikari-skala) og en prøve av avføring vil bli samlet inn for bestemmelse av rotavirusantigen og genotype hvis rotavirus er positivt. Pasienten vil også bli sendt hjem med en diarédagbok som skal fylles ut i løpet av de neste to ukene. Etter identifisering av et barn med alvorlig gastroenteritt, vil en alderstilpasset kontroll fra kohorten (uten nylig gastroenteritt) bli hentet inn for måling av vitamin A og serumsinknivåer. Barn med gastroenteritt vil bli behandlet i henhold til nasjonale retningslinjer (i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) Integrated Management of Childhood Illness). Ved behov for henvisning henvises barnet til poliklinikk, eller i alvorlige tilfeller Universitetssykehuset.

Studieprosedyrer. Samme som ovenfor.

Laboratoriemetoder.

1. Påvisning av Rotavirus-spesifikk IgA og IgG vil skje ved ELISA. Påvisning av rotavirusspesifikk IgA og IgG vil skje ved ELISA. Kort fortalt er fremgangsmåten som følger. Mikroplatebrønner (f.eks. Nunc Immuno I) inkuberes med rensede virale antigenpreparater, deretter vaskes med fosfatbufret saltvann med Tween-vaskemiddel (PBS-T). Serum- og morsmelkprøver fortynnes serielt (i PBS-T som inneholder 1 % bovint serumalbumin) og inkuberes i de belagte mikroplatene i 2 timer ved 37oC og deretter over natten ved 4oC. Mikroplater vaskes deretter og peroksidase-konjugerte anti-humane IgA- eller IgG-geiteantistoffer (Sigma Immunochemicals) tilsettes. Reaksjonen avsluttes deretter med H2SO4, og optisk tetthet måles med EIA plateleser. Alle prøver analyseres i duplikat mot hvert viralt antigen og mot et kontrollantigen. En testbrønn ble ansett som positiv av dens optiske tetthet ved 450 nm, for eksempel hvis den er større enn eller lik to ganger dens egen kontroll. Spesifisiteten kontrolleres ved å inkludere brønner som inneholder kontrollantigen inkubert i fravær av prøven, og sensitiviteten kontrolleres ved å inkludere brønner som inneholder viralt antigen inkubert i nærvær av prøver som er kjent for å inneholde høy titer av en spesiell rotavirusspesifikk immunglobulinklasse.
2. Påvisning av Rotavirus Antigen vil skje ved Rotaclon ELISA. Avføringsprøver vil bli testet for rotavirus ved ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Kort fortalt vil prøven bringes til romtemperatur og fortynnes med bufret saltvann med 0,02 % timerosol. Fortynnet prøve og enzymkonjugat inkuberes deretter med et monoklonalt antistoff mot VP6-proteinet i Rotaclon-mikroplaten. Substratbuffere som inneholder ureaperoksid og tetrametylbenzidin tilsettes deretter, og reaksjonen avsluttes med H2SO4. Spektrofotometrisk bestemmelse av resultatet gjøres deretter ved å måle absorbansen ved 450 nm mot et luftemne. Prøver med absorbansenheter (A450) større enn 0,150 anses som positive. De med absorbans lik eller under 0,150 anses som negative.

3 Bestemmelse av rotavirus VP7 genotype. Viralt RNA ekstraheres fra en 10 % suspensjon av rotavirus-antigenpositivt fekalt materiale i PBS (pH 7,0) ved bruk av TRIzolTM Reagent (GIBCO Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll. Viralt RNA blir deretter tatt gjennom RT-PCR som beskrevet tidligere.

Ekstrahert viralt RNA blir deretter tatt gjennom nestet PCR ved bruk av primere som er komplementære til 3'-endene av begge virale RNA-tråder i gensegment 9, som koder for viralt protein 7 (VP7). Disse primerne brukes til syntese av første tråd. Primer RVG9 ​​og seks serotypespesifikke primere (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 og aFT9) som er lokalisert i seks variable regioner på genet 9 og tilsvarer G-serotype 1, 2, 3, 4, 8 og 9 , brukes i andre amplifikasjon. Kort fortalt denatureres 5 ul RNA med 25 pmol av hver primer Beg9 og End9 i 5 minutter ved 97°C og avkjøles på is. Deretter, 8 µl RT-reaksjonsblanding inneholdende 1,5 µl 10X PCR-buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mM av hver dATP, dCTP, dTP og dCTP dTTP, 10 U AMV revers transkriptase (Promega) og 20 U Rnasin ribonukleasehemmer (Promega), tilsettes til prøve-primerblandingen og inkuberes ved 42°C i 60 minutter. PCR-bufferblanding (35 µl), inneholdende 3,5 µl 10X PCR-buffer, 2 µl 2,5 mM fersken-dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA-polymerase (Perkin Elmer) og 27 µl vann tilsettes til RT-reaksjonen. Reaksjonsblandingen denatureres ved 94 °C i 3 minutter, etterfulgt av 30 sykluser (1 min ved 94 °C, 2 minutter ved 42 °C, 3 minutter ved 72 °C) og en siste forlengelse på 5 minutter ved 72 °C .

Førsterunde PCR-produkter (2 µl) overføres til 48 µl andre PCR-reaksjonsblanding, inneholdende 5 µl 10X PCR-buffer, 25 pmol hver primer aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 og RVG9, 0,2 mM hver dATP , dGTP, dCTP og dTTP, 2mM MgCl2, 2,5 U Taq-polymerase. Sykkelforholdene i andre runde er identiske med første runde, bortsett fra at det kun kjøres 25 sykluser. PCR-produktene analyseres ved gelelektroforese for å identifisere forventede lengder av amplifisert VP7, noe som muliggjør bestemmelse av genotype. Andre primersett, PCR-betingelser og/eller sekvensering brukes for å skille genotype når/hvis de første primerne mislykkes.

4 Bestemmelse av VP4-genotype. Strategien for PCR-typing av gen 4 er i prinsippet identisk med den som brukes for VP7.64 Første trådsyntese (revers transkripsjon) drar fordel av svært konserverte områder av VP4 ved å bruke primerne Con2 og Con3 (boks 3), som er komplementære til 3'-endene av begge virale RNA-trådene i gensegment 4. 1 til 5 µL viralt RNA tilsettes til 0,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 3,5 µl dimetylsulfoksid (Sigma) i et sluttvolum på 8,5 µl, og prøvene blandes og denaturert ved 97°C i 5 min. Prøvene avkjøles deretter på is i 5 minutter og samles ved kort sentrifugering. 13,5 µL H20, 16 µL deoksynukleosidtrifosfater (1,25 mM hver dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 5 µL 1OX buffer (100 mM Tris-hydroklorid [pH 8,3], 500 mM KCl) 3,5 µL 25 mM MgCl2, 2 µl primer (som inneholder 25 µM av hver primer, Con 2 og Con 3), og 9 U revers transkriptase tilsettes deretter til hvert denaturert dsRNA-prøverør (for å gi et endelig reaksjonsvolum på 49 µ1 ) og inkubert ved 42oC i 60 minutter.

Etter tilsetning av 1 µL (1,9 U) Taq-polymerase og 100 µL mineralolje, utføres første runde PCR i 30 sykluser (1 min 94oC, 2 min ved 50oC og 2 min ved 72oC. En kjølesyklus brukes for å bringe prøvene til 17OC ved fullføring av eksperimentet. Andre-runde-typingsreaksjonen, hvis den utføres ved bruk av 0,5 til 5 µL av første-runde-produktet (5 µL hvis det ikke er noe synlig produkt; 0,5 µL hvis synlig produkt) blandes med 45 µL reaksjonsblanding i et sluttvolum på 50 µL. Hvis mindre enn 5 µL av første runde produkt tilsettes, er det gjenværende volumet, for å fullføre 50 µL, 10 mM TrisHCl (pH 8,3) - 2,5 mM MgCl¬2. Reaksjonsblandingen er 19,5 µL vann, 16 µL dNTPs, 5 µL 10X Buffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL av primercocktailen (inneholder 20 µM hver av Con3, 1T-1, 3T-1, 3T-1, og 4T-1), og 0,5 µL (2,5 U) Taq. Prøvene dekkes med mineralolje og tas gjennom 25 runder med PCR (samme sykluser som første runde). Prøvene blir deretter analysert ved gelelektroforese og produktstørrelse muliggjør bestemmelse av VP4-genotype. Andre primersett og/eller sekvensering brukes for å skille genotype når/hvis de første primerne svikter.

5 Bestemmelse av vitamin A- og sinknivåer: Serumprøver vil bli evaluert for vitamin A-nivå ved ELISA (f.eks. Human Vitamin A, EIAAB) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt er mikrotiterplaten som følger med i dette settet, forhåndsbelagt med et antistoff spesifikt for vitamin A. Standarder eller prøver tilsettes deretter til passende mikrotiterplatebrønner med et biotinkonjugert polyklonalt antistoffpreparat spesifikt for VA og Avidin konjugert til pepperrot Peroksidase (HRP) tilsettes til hver mikroplatebrønn og inkuberes. Deretter tilsettes en tetrametylbenzidin-substratløsning til hver brønn. Bare de brønnene som inneholder vitamin A, biotin-konjugert antistoff og enzym-konjugert Avidin vil vise en endring i farge. Enzym-substratreaksjonen avsluttes ved tilsetning av en H2SO4 og fargeendringen måles spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm. Konsentrasjonen av VA i prøvene bestemmes deretter ved å sammenligne O.D. av prøvene til standardkurven.

Sinknivåer vil bli målt fra blod ved hjelp av analyser som Lampugnanis enkle kolorimetriske metode som bruker en spektrofotometrisk metode med kromogen 4-(2-pyridylazo) resorcinolnatriumsalt for å måle serumsinkkonsentrasjoner.