Årsager til rotavirusvaccinesvigt hos zambiske børn

Undersøgelsen vil blive udført på Kamwala sundhedsfacilitet i Lusaka, hvor klinikker for Maternal Child Health (MCH) og antiretroviral terapi (ART) samt Center for Infectious Disease Research Zambia (CIDRZ) Kamwala Research Unit er samlokaliseret. Kamwala har en befolkning i oplandet på over 10.000 med ca. 30 nye spædbørn, der præsenterer sig for MCH hver måned med 6-14 ugers (DPT-HiB-Hep) immuniseringsrater på over 95 %. Moder-spædbarn-par vil blive kontaktet under det første besøg på MCH af studieklinikassistenten eller peer-vejlederen med information om denne undersøgelse på det lokale valg. De generelt interesserede vil blive inviteret til forskningsklinikken, som ligger tæt på, for mere detaljeret information, hvor motiverede mødre vil blive rekrutteret og taget gennem den skriftlige informerede samtykkeproces af undersøgelsens sygeplejerske. For analfabeter vil en uafhængig, læsekyndig person være vidne til og validere processen med informeret samtykke. En specifik log vil blive vedligeholdt for at vise oplysninger om datoer og antal af de inviterede til undersøgelsen, årsagerne til afslaget dokumenteret.

En senior forskningssygeplejerske, undersøgelsessygeplejerske og klinisk forskningsassistent vil være ansvarlige for informeret samtykke og tilmeldingsprocedurer under supervision af investigator. En børnelæge vil være tilgængelig for praktisk konsultation, når det er nødvendigt.

Kohorteopfølgning. Tilmeldte mødre vil blive bedt om at udfylde demografiske og adfærdsmæssige spørgeskemaer, en deltagerlokaliseringsformular og gennemgå phlebotomi og mekanisk ekspression af modermælk ved tilmeldingsbesøget for at bestemme anti-rotavirus IgG og IgA (i serum og modermælk). Spædbørn vil have en baseline anti-rotavirus IgA og IgG antistoffer bestemt til at fastslå baseline eksponering for vildtype og transplacental immunglobulin efterfulgt af en anden serum IgA bestemmelse en måned efter afslutning af rotavirus vaccination (ved ca. 14-20 uger).

Spædbørn vil derefter blive fulgt kvartalsvis i klinikken i resten af ​​undersøgelsen og vil også foretage midlertidige klinikbesøg, hvis barnet har diarré. Ved hvert besøg vil barnet blive vejet, højdemålt og antropometri taget, inklusive hudfold for subkutant kropsfedt og midterste overarms omkreds. Under eventuelle symptomatiske midlertidige besøg vil der blive foretaget vurderinger af sygdommens sværhedsgrad (ved Vesikari-skala), og en prøve af afføring vil blive indsamlet til bestemmelse af rotavirus-antigen og genotype, hvis rotavirus-positiv. Patienten vil også blive sendt hjem med en diarrédagbog, der skal udfyldes i løbet af de følgende to uger. Efter identifikation af et barn med svær gastroenteritis, vil en alderssvarende kontrol fra kohorten (uden nylig gastroenteritis) blive hentet ind til måling af vitamin A og serum zink niveauer. Børn med gastroenteritis vil blive behandlet i overensstemmelse med nationale retningslinjer (i henhold til Verdenssundhedsorganisationens (WHO) Integrated Management of Childhood Illness). Ved behov for henvisning henvises barnet til ambulatorium eller i alvorlige tilfælde Universitetshospitalet.

Studieprocedurer. Samme som ovenfor.

Laboratoriemetoder.

1. Påvisning af Rotavirus-specifik IgA og IgG vil ske ved ELISA. Påvisning af rotavirus-specifik IgA og IgG vil ske ved ELISA. Kort fortalt er proceduren som følger. Mikropladebrønde (f.eks. Nunc Immuno I) inkuberes med oprensede virale antigenpræparater og vaskes derefter med phosphatbufret saltvand med Tween-detergent (PBS-T). Serum- og modermælksprøver fortyndes serielt (i PBS-T indeholdende 1 % bovint serumalbumin) og inkuberes i de coatede mikroplader i 2 timer ved 37oC og derefter natten over ved 4oC. Mikroplader vaskes derefter, og peroxidase-konjugerede anti-humane IgA- eller IgG-gedeantistoffer (Sigma Immunochemicals) tilsættes. Reaktionen afsluttes derefter med H2SO4, og optisk densitet måles med EIA-pladelæser. Alle prøver analyseres in duplo mod hvert viralt antigen og mod et kontrolantigen. En testbrønd blev betragtet som positiv af dens optiske tæthed ved 450 nm, f.eks. hvis den er større end eller lig med to gange dens egen kontrol. Specificiteten kontrolleres ved at inkludere brønde indeholdende kontrolantigen inkuberet i fravær af prøven, og følsomheden kontrolleres ved at inkludere brønde indeholdende viralt antigen inkuberet i nærværelse af prøver, der vides at indeholde høj titer af en bestemt rotavirus-specifik immunoglobulinklasse.
2. Påvisning af Rotavirus-antigen vil ske ved Rotaclon ELISA. Afføringsprøver vil blive testet for rotavirus ved ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) i henhold til producentens specifikationer. Kort fortalt bringes prøven til stuetemperatur og fortyndes med bufferet saltvand med 0,02 % thimerosol. Fortyndet prøve og enzymkonjugat inkuberes derefter med et monoklonalt antistof mod VP6-proteinet i Rotaclon-mikropladen. Substratbuffere indeholdende urinstofperoxid og tetramethylbenzidin tilsættes derefter, og reaktionen afsluttes med H2SO4. Spektrofotometrisk bestemmelse af resultatet foretages derefter ved at måle absorbansen ved 450 nm mod en luftblindprøve. Prøver med absorbansenheder (A450) større end 0,150 betragtes som positive. Dem med absorbans lig med eller under 0,150 betragtes som negative.

3 Bestemmelse af rotavirus VP7 genotype. Viralt RNA ekstraheres fra en 10 % suspension af rotavirus-antigen-positivt fæcesmateriale i PBS (pH 7,0) ved hjælp af TRIzolTM Reagent (GIBCO Life Technologies) i henhold til producentens protokol. Viralt RNA tages derefter gennem RT-PCR som beskrevet tidligere.

Ekstraheret viralt RNA tages derefter gennem nestet PCR under anvendelse af primere, som er komplementære til 3'-enderne af begge virale RNA-strenge i gensegment 9, som koder for viralt protein 7 (VP7). Disse primere anvendes til syntese af første streng. Primer RVG9 ​​og seks serotype-specifikke primere (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 og aFT9), som er placeret i seks variable regioner på genet 9 og svarer til G-serotype 1, 2, 3, 4, 8 og 9 , anvendes i anden amplifikation. Kort fortalt denatureres 5 µl RNA med 25 pmol af hver primer Beg9 og End9 i 5 minutter ved 97°C og afkøles på is. Derefter 8 µl RT-reaktionsblanding indeholdende 1,5 µl 10X PCR-buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mM af hver dATP, dCTP, dATP, dCTP, dTTP, 10 U AMV revers transkriptase (Promega) og 20 U Rnasin-ribonukleasehæmmer (Promega) tilsættes til prøve-primerblandingen og inkuberes ved 42°C i 60 min. PCR-bufferblanding (35 µl), indeholdende 3,5 µl 10X PCR-buffer, 2 µl 2,5 mM fersken-dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 2,5 U AmpliTaq DNA-polymerase (Perkin Elmer) og 27 µl reaktionsvand tilsættes. Reaktionsblandingen denatureres ved 94°C i 3 minutter, efterfulgt af 30 cyklusser (1 minut ved 94°C, 2 minutter ved 42°C, 3 minutter ved 72°C) og en sidste forlængelse på 5 minutter ved 72°C. .

Første runde PCR-produkter (2 µl) overføres til 48 µl anden PCR-reaktionsblanding indeholdende 5 µl 10X PCR-buffer, 25 pmol hver primere aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 og RVG9, 0,2 mM hver dATP dGTP, dCTP og dTTP, 2mM MgCl2, 2,5 U Taq-polymerase. Cykelforholdene i anden runde er identiske med første runde, bortset fra at der kun køres 25 cykler. PCR-produkterne analyseres ved gelelektroforese for at identificere forventede længder af amplificeret VP7, hvilket muliggør bestemmelse af genotype. Andre primersæt, PCR-betingelser og/eller sekventering bruges til at skelne genotype, når/hvis de indledende primere fejler.

4 Bestemmelse af VP4-genotype. Strategien for PCR-typebestemmelse af gen 4 er principielt identisk med den, der anvendes til VP7.64 Førstestrengssyntese (revers transkription) drager fordel af stærkt konserverede områder af VP4 ved hjælp af primerne Con2 og Con3 (boks 3), som er komplementære til 3'-enderne af begge virale RNA-strenge i gensegment 4. 1 til 5 µL viralt RNA tilsættes til 0,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 3,5 µl dimethylsulfoxid (Sigma) i et slutvolumen på 8,5 µl, og prøverne blandes og denatureret ved 97°C i 5 min. Prøverne afkøles derefter på is i 5 minutter og opsamles ved kort centrifugering. 13,5 µL H20, 16 µL deoxynukleosidtriphosphater (1,25 mM hver dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 5 µL 1OX buffer (100 mM Tris-hydrochlorid [pH 8,3], 500 mM KCl) 3,5 µL 25 mM MgCl2, 2 µl primer (indeholdende 25 µM af hver primer, Con 2 og Con 3) og 9 U revers transkriptase tilsættes derefter til hvert denatureret dsRNA-prøverør (for at give et slutreaktionsvolumen på 49 µ1 ) og inkuberes ved 42oC i 60 minutter.

Efter tilsætning af 1 µL (1,9 U) Taq-polymerase og 100 µL mineralolie udføres første runde PCR i 30 cyklusser (1 min 94oC, 2 min ved 50oC og 2 min ved 72oC. En afkølingscyklus bruges til at bringe prøverne til 17°C ved afslutningen af ​​eksperimentet. Typeringsreaktionen i anden runde, hvis den udføres med 0,5 til 5 µL af første-runde-produktet (5 µL, hvis der ikke er noget synligt produkt; 0,5 µL, hvis det er synligt produkt), blandes med 45 µL reaktionsblanding i et slutvolumen på 50 µL. Hvis mindre end 5 µL af første runde produkt tilsættes, er det resterende volumen, for at fuldføre 50 µL, 10 mM TrisHCl (pH 8,3)-2,5 mM MgCl¬2. Reaktionsblandingen er 19,5 µL vand, 16 µL dNTP'er, 5 µL 10X Buffer II, 3 µL 25 mM MgCl2, 1 µL af primercocktailen (indeholdende 20 µM hver af Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, og 4T-1), og 0,5 µL (2,5 U) Taq. Prøverne overlejres med mineralolie og tages gennem 25 runder PCR (samme cyklusser som første runde). Prøverne analyseres derefter ved gelelektroforese, og produktstørrelsen muliggør bestemmelse af VP4-genotype. Andre primersæt og/eller sekventering bruges til at skelne genotype, når/hvis de indledende primere fejler.

5 Bestemmelse af vitamin A og zink niveauer: Serumprøver vil blive evalueret for vitamin A niveau ved ELISA (f.eks. Human Vitamin A, EIAAB) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt er mikrotiterpladen, der leveres i dette kit, blevet præ-coatet med et antistof, der er specifikt for vitamin A. Standarder eller prøver tilsættes derefter til de passende mikrotiterpladebrønde med et biotin-konjugeret polyklonalt antistofpræparat, der er specifikt for VA og Avidin konjugeret til peberrod Peroxidase (HRP) tilsættes til hver mikropladebrønd og inkuberes. Derefter tilsættes en tetramethylbenzidin-substratopløsning til hver brønd. Kun de brønde, der indeholder vitamin A, biotin-konjugeret antistof og enzym-konjugeret Avidin, vil udvise en ændring i farve. Enzym-substrat-reaktionen afsluttes ved tilsætning af en H2SO4, og farveændringen måles spektrofotometrisk ved en bølgelængde på 450 nm. Koncentrationen af ​​VA i prøverne bestemmes derefter ved at sammenligne O.D. af prøverne til standardkurven.

Zinkniveauer vil blive målt fra blod ved hjælp af analyser såsom Lampugnanis simple kolorimetriske metode, som bruger en spektrofotometrisk metode med kromogen 4-(2-pyridylazo) resorcinolnatriumsalt til at måle serumzinkkoncentrationer.