Rotavirusrokotteen epäonnistumisen syyt sambian lapsilla

Tutkimus suoritetaan Kamwalan terveyskeskuksessa Lusakassa, jossa sijaitsevat äidin lapsen terveyden (MCH) ja antiretroviraalisen hoidon (ART) klinikat sekä Sambian tartuntatautien tutkimuskeskuksen (CIDRZ) Kamwalan tutkimusyksikkö. Kamwalan valuma-alueen väestö on yli 10 000, ja noin 30 uutta vauvaa saapuu MCH:lle kuukaudessa ja 6-14 viikon (DPT-HiB-Hep) immunisaatioaste on yli 95 %. Tutkimusklinikan assistentti tai vertaisohjaaja ottaa äiti-vauva-parien puoleen MCH-käynnin aikana ja antaa tietoa tästä tutkimuksesta valitsemallasi paikallisella kielellä. Yleisesti kiinnostuneet kutsutaan läheiselle tutkimusklinikalle tarkempia tietoja varten, joiden aikana motivoituneita äitejä rekrytoidaan ja viedään tutkimushoitajan kirjallisen tietoisen suostumusprosessin kautta. Lukutaidottomien osallistujien osalta riippumaton, lukutaitoinen henkilö todistaa ja vahvistaa tietoisen suostumusprosessin. Pidetään erityinen loki, josta näkyy tiedot tutkimukseen kutsuttujen päivämääristä ja lukumäärästä sekä kieltäytymisen syyt dokumentoidaan.

Vanhempi tutkimussairaanhoitaja, tutkimussairaanhoitaja ja kliininen tutkimusassistentti vastaavat tietoon perustuvasta suostumuksesta ja ilmoittautumismenettelyistä tutkijan valvonnassa. Lastenlääkäri on tarvittaessa käytettävissä käytännön konsultaatiossa.

Kohortin seuranta. Ilmoittautuneita äitejä pyydetään täyttämään demografiset ja käyttäytymiskyselyt, osallistujan paikannuslomake sekä flebotomia ja rintamaidon mekaaninen ilmentäminen ilmoittautumiskäynnillä rotaviruksen vastaisen IgG:n ja IgA:n määrittämiseksi (seerumissa ja rintamaidossa). Imeväisille on määritetty lähtötilanteessa rotaviruksen vastaiset IgA- ja IgG-vasta-aineet, jotta voidaan varmistaa lähtötason altistuminen villityypin ja istukan kautta tapahtuvalle immunoglobuliinille, minkä jälkeen suoritetaan toinen seerumin IgA-määritys kuukauden kuluttua rotavirusrokotuksen päättymisestä (noin 14-20 viikon kohdalla).

Sitten pikkulapsia seurataan neljännesvuosittain klinikalla loppututkimuksen ajan, ja he tekevät myös väliaikaisia ​​klinikkakäyntejä, jos lapsella on ripuli. Jokaisella käynnillä lapsi punnitaan, mitataan pituus ja mitataan antropometria, mukaan lukien ihopoimu ihonalaisen rasvan ja olkavarren keskiosan mittaamiseksi. Oireisten välikäyntien aikana arvioidaan taudin vakavuus (Veskari-asteikolla) ja ulosteesta otetaan näyte rotaviruksen antigeenin ja genotyypin määrittämiseksi, jos rotavirus on positiivinen. Potilas lähetetään myös kotiin ripulipäiväkirjalla, joka täytetään seuraavan kahden viikon aikana. Vaikeasta maha-suolitulehduksesta kärsivän lapsen tunnistamisen jälkeen kohortin sisältä (ilman äskettäistä maha-suolitulehdusta) tuodaan A-vitamiini- ja seerumin sinkkipitoisuuksien mittaamista varten iän mukainen kontrolli. Gastroenteriittiä sairastavia lapsia hoidetaan kansallisten ohjeiden mukaisesti (WHO:n integroidun lastensairauksien hallinnan mukaisesti). Jos tarvitaan lähete, lapsi ohjataan poliklinikalle tai vakavissa tapauksissa yliopistolliseen opetussairaalaan.

Tutkimusmenettelyt. Sama kuin edellä.

Laboratoriomenetelmät.

1. Rotavirusspesifinen IgA ja IgG havaitaan ELISA:lla. Rotavirusspesifinen IgA ja IgG havaitaan ELISA:lla. Lyhyesti sanottuna menettely on seuraava. Mikrolevyn kuoppia (esim. Nunc Immuno I) inkuboidaan puhdistettujen virusantigeenivalmisteiden kanssa, sitten pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella Tween-detergentillä (PBS-T). Seerumi- ja rintamaitonäytteet laimennetaan sarjassa (PBS-T:ssä, joka sisältää 1 % naudan seerumialbumiinia) ja inkuboidaan päällystetyillä mikrolevyillä 2 tuntia 37 °C:ssa ja sitten yön yli 4 °C:ssa. Mikrolevyt pestään sitten ja lisätään peroksidaasikonjugoituja anti-ihmisen IgA- tai IgG-vuohen vasta-aineita (Sigma Immunochemicals). Sitten reaktio päätetään H2S04:llä ja optinen tiheys mitataan EIA-levynlukijalla. Kaikki näytteet analysoidaan kahtena rinnakkaisena kutakin virusantigeeniä ja kontrolliantigeenia vastaan. Koekaivoa pidettiin positiivisena sen optisen tiheyden perusteella 450 nm:ssä, esimerkiksi jos se on suurempi tai yhtä suuri kuin kaksi kertaa sen omaan kontrolliin verrattuna. Spesifisyyttä kontrolloidaan sisällyttämällä kaivoksia, jotka sisältävät kontrolliantigeenia, jota on inkuboitu näytteen poissa ollessa, ja herkkyys tarkistetaan sisällyttämällä kaivoksia, jotka sisältävät virusantigeenia, jota on inkuboitu sellaisten näytteiden läsnä ollessa, joiden tiedetään sisältävän korkean titterin tietyn rotavirusspesifisen immunoglobuliiniluokan.
2. Rotavirusantigeenin havaitseminen tapahtuu Rotaclone ELISA:lla. Ulostenäytteet testataan rotaviruksen varalta ELISA:lla (Rotaclone®, Meridian Biosciences) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna näyte saatetaan huoneenlämpötilaan ja laimennetaan puskuroidulla suolaliuoksella, jossa on 0,02 % timerosolia. Laimennettua näytettä ja entsyymikonjugaattia inkuboidaan sitten VP6-proteiinin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa Rotaclone-mikrolevyllä. Sitten lisätään substraattipuskurit, jotka sisältävät ureaperoksidia ja tetrametyylibentsidiiniä, ja reaktio päätetään H2S04:lla. Tuloksen spektrofotometrinen määritys tehdään sitten mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 450 nm ilmanollaa vastaan. Näytteitä, joiden absorbanssiyksikkö (A450) on suurempi kuin 0,150, pidetään positiivisina. Ne, joiden absorbanssi on 0,150 tai pienempi, katsotaan negatiivisiksi.

3 Rotaviruksen VP7 genotyypin määritys. Viruksen RNA uutetaan 10-prosenttisesta rotavirusantigeenipositiivisen ulostemateriaalin suspensiosta PBS:ssä (pH 7,0) käyttämällä TRIzolTM-reagenssia (GIBCO Life Technologies) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Viruksen RNA otetaan sitten RT-PCR:n läpi, kuten aiemmin on kuvattu.

Uutettu virus-RNA otetaan sitten sisäkkäisen PCR:n läpi käyttämällä alukkeita, jotka ovat komplementaarisia molempien viruksen RNA-juosteiden 3'-päiden kanssa geenisegmentissä 9, joka koodaa virusproteiinia 7 (VP7). Näitä alukkeita käytetään ensimmäisen juosteen synteesiin. Aluke RVG9 ​​ja kuusi serotyyppispesifistä aluketta (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 ja aFT9), jotka sijaitsevat geenin 9 kuudella vaihtelevalla alueella ja vastaavat G-serotyyppejä 1, 2, 3, 4, 8 ja 9 , käytetään toisessa vahvistuksessa. Lyhyesti sanottuna 5 ui RNA:ta, jossa on 25 pmol kutakin aluketta Beg9 ja End9, denaturoidaan 5 minuutin ajan 97 °C:ssa ja jäähdytetään jäillä. Sen jälkeen 8 µl RT-reaktioseosta, joka sisälsi 1,5 µl 10X PCR-puskuria (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 2,5 mP, dGTPdAT ja dTPdAT kutakin dTTP, 10 U AMV-käänteiskopioijaentsyymi (Promega) ja 20 U Rnasiiniribonukleaasi-inhibiittori (Promega) lisätään näyte-aluke-seokseen ja inkuboidaan 42 °C:ssa 60 minuuttia. Lisätään PCR-puskuriseosta (35 µl), joka sisältää 3,5 µl 10X PCR-puskuria, 2 µl 2,5 mM persikka-dATP:tä, dCTP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä, 2,5 U AmpliTaq DNA -polymeraasia (Perkin Elmer) ja 27 µl RT-reaktiota. Reaktioseos denaturoidaan 94 °C:ssa 3 minuutin ajan, jota seuraa 30 sykliä (1 min 94 °C:ssa, 2 min 42 °C:ssa, 3 min 72 °C:ssa) ja lopullinen pidennys 5 minuuttia 72 °C:ssa. .

Ensimmäisen kierroksen PCR-tuotteet (2 µl) siirretään 48 µl:aan toista PCR-reaktioseosta, joka sisältää 5 µl 10X PCR-puskuria, 25 pmol kutakin aluketta aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 ja RVG9, kutakin 0,2 mM dATP dGTP, dCTP ja dTTP, 2 mM MgCl2, 2,5 U Taq-polymeraasia. Toisen kierroksen pyöräilyolosuhteet ovat samat kuin ensimmäisen kierroksen, paitsi että ajetaan vain 25 kierrosta. PCR-tuotteet analysoidaan geelielektroforeesilla monistetun VP7:n odotettujen pituuksien tunnistamiseksi, mikä mahdollistaa genotyypin määrittämisen. Muita alukesarjoja, PCR-olosuhteita ja/tai sekvensointia käytetään genotyypin erottamiseen, kun/jos alkuperäiset alukkeet epäonnistuvat.

4 VP4-genotyypin määritys. Strategia geenin 4 PCR-tyypitykseen on periaatteessa identtinen VP7:n kanssa. Ensimmäisen juosteen synteesi (käänteistranskriptio) hyödyntää VP4:n erittäin konservoituneita alueita käyttämällä alukkeita Con2 ja Con3 (laatikko 3), jotka täydentävät alukkeita. molempien virus-RNA-juosteiden 3'-päät geenisegmentissä 4. 1-5 µl virus-RNA:ta lisätään 0,5 ml:n mikrosentrifugiputkiin, jotka sisältävät 3,5 µl dimetyylisulfoksidia (Sigma) lopullisessa tilavuudessa 8,5 µl, ja näytteet sekoitetaan ja denaturoitu 97 °C:ssa 5 minuuttia. Näytteitä jäähdytetään sitten jäillä 5 minuutin ajan ja kerätään lyhyellä sentrifugoinnilla. 13,5 µl H20, 16 µl deoksinukleosiditrifosfaatteja (1,25 mM kumpikin dATP, dGTP, dCTP ja dTTP), 5 µl 1OX-puskuria (100 mM Tris-hydrokloridia [pH 8,03], K-Cl003) 3,5 µl 25 mM MgCl2:a, 2 µl aluketta (sisältää 25 µM kutakin aluketta, Con 2 ja Con 3) ja 9 U käänteistranskriptaasia lisätään sitten jokaiseen denaturoituun dsRNA-näyteputkeen (jotta saadaan lopullinen reaktiotilavuus 49 µ1 ) ja inkuboitiin 42 oC:ssa 60 minuuttia.

Sen jälkeen kun on lisätty 1 µl (1,9 U) Taq-polymeraasia ja 100 µl mineraaliöljyä, suoritetaan ensimmäinen PCR 30 syklin ajan (1 min 94 oC, 2 min 50 oC ja 2 min 72 oC). Jäähdytyssykliä käytetään näytteiden saattamiseksi 17 °C:seen kokeen päätyttyä. Toisen kierroksen tyypitysreaktio, jos se suoritetaan käyttämällä 0,5-5 µl ensimmäisen kierroksen tuotetta (5 µl, jos ei näkyvää tuotetta; 0,5 µl, jos näkyvää tuotetta), sekoitetaan 45 µl:aan reaktioseosta lopullisessa tilavuudessa 50 µl. Jos lisätään alle 5 µl ensimmäisen kierroksen tuotetta, jäljellä oleva tilavuus, jotta saadaan 50 µl, on 10 mM TrisHCl (pH 8,3) - 2,5 mM MgCl¬2. Reaktioseos on 19,5 µl vettä, 16 µl dNTP:tä, 5 µl 10X puskuria II, 3 µl 25 mM MgCl2:a, 1 µl alukeseosta (sisältää kutakin 20 µM Con3, 1T-1, 3T-1, 3T-1, 3T-1 ja 4T-1) ja 0,5 ui (2,5 U) Taq. Näytteet peitetään mineraaliöljyllä ja otetaan 25 PCR-kierroksen läpi (samat syklit kuin ensimmäinen kierros). Näytteet analysoidaan sitten geelielektroforeesilla ja tuotteen koko mahdollistaa VP4-genotyypin määrittämisen. Muita alukesarjoja ja/tai sekvensointia käytetään genotyypin erottamiseen, kun/jos alkuperäiset alukkeet epäonnistuvat.

5 A-vitamiini- ja sinkkitasojen määrittäminen: Seeruminäytteiden A-vitamiinitaso arvioidaan ELISA:lla (esim. ihmisen A-vitamiini, EIAAB) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna tässä sarjassa oleva mikrotiitterilevy on esipäällystetty A-vitamiinille spesifisellä vasta-aineella. Standardit tai näytteet lisätään sitten asianmukaisiin mikrotiitterilevyn kuoppiin biotiinilla konjugoidulla polyklonaalisella vasta-ainevalmisteella, joka on spesifinen VA:lle ja Avidiinille konjugoitu piparjuureen. Peroksidaasia (HRP) lisätään kuhunkin mikrolevyn kuoppaan ja inkuboidaan. Sitten kuhunkin kuoppaan lisätään tetrametyylibentsidiini-substraattiliuosta. Vain ne kuopat, jotka sisältävät A-vitamiinia, biotiinilla konjugoitua vasta-ainetta ja entsyymikonjugoitua avidiinia, osoittavat värimuutosta. Entsyymi-substraattireaktio lopetetaan lisäämällä H2S04:ää ja värinmuutos mitataan spektrofotometrisesti aallonpituudella 450 nm. VA:n pitoisuus näytteissä määritetään sitten vertaamalla O.D. näytteistä standardikäyrään.

Sinkkipitoisuudet mitataan verestä käyttämällä määrityksiä, kuten Lampugnanin yksinkertaista kolorimetristä menetelmää, jossa seerumin sinkkipitoisuuksien mittaamiseen käytetään spektrofotometristä menetelmää kromogeenin 4-(2-pyridyyliatso)resorsinolinatriumsuolan kanssa.