잠비아 어린이의 로타바이러스 백신 실패 원인

이 연구는 MCH(Maternal Child Health) 및 ART(antiretroviral therapy) 클리닉과 잠비아 전염병 연구 센터(CIDRZ) Kamwala Research Unit이 함께 위치한 Lusaka의 Kamwala 건강 시설에서 실시될 예정입니다. Kamwala는 10,000명 이상의 집수 인구를 보유하고 있으며 매월 약 30명의 신생아가 MCH에 출석하며 6-14주(DPT-HiB-Hep) 예방접종률은 95% 이상입니다. 어머니-유아 쌍은 MCH에 처음 방문하는 동안 선택한 현지 언어로 이 연구에 대한 정보와 함께 연구 임상 조교 또는 동료 상담사가 접근할 것입니다. 일반적으로 관심이 있는 사람들은 가까운 연구 클리닉에 초대되어 더 자세한 정보를 얻을 수 있으며, 그 동안 연구 간호사의 서면 동의 절차를 통해 동기 부여된 어머니를 모집하고 데려갈 것입니다. 문맹 참가자의 경우 독립적이고 문맹인 개인이 정보에 입각한 동의 프로세스를 목격하고 검증합니다. 연구에 초대된 사람들의 날짜와 숫자, 문서화된 거부 이유에 대한 정보를 표시하기 위해 특정 로그가 유지됩니다.

선임 연구 간호사, 연구 간호사 및 임상 연구 보조원은 조사자의 감독하에 정보에 입각한 동의 및 등록 절차를 담당합니다. 필요한 경우 소아과 의사가 직접 상담할 수 있습니다.

코호트 후속 조치. 등록된 어머니는 인구통계 및 행동 설문지, 참가자 로케이터 양식을 작성하고 등록 방문 시 항로타바이러스 IgG 및 IgA(혈청 및 모유 내)를 결정하기 위해 정맥 절개 및 모유의 기계적 유축을 받아야 합니다. 영아는 야생형 및 태반 면역글로불린에 대한 기준선 노출을 확인하기 위해 기준선 항로타바이러스 IgA 및 IgG 항체를 측정한 후 로타바이러스 백신 접종 완료 후 1개월(약 14-20주)에 두 번째 혈청 IgA 측정을 합니다.

그런 다음 영아는 연구의 나머지 기간 동안 분기별로 병원 내에서 추적되며 어린이가 설사를 하는 경우 중간 클리닉 방문도 합니다. 방문할 때마다 아이의 체중과 키를 측정하고 피하 체지방과 상완 중간 둘레에 대한 피부 접힘을 포함하여 인체 측정을 ​​수행합니다. 증상이 있는 임시 방문 중에 질병 중증도(Vesikari 척도에 따라)를 평가하고 로타바이러스 양성인 경우 로타바이러스 항원 및 유전자형을 결정하기 위해 대변 샘플을 수집합니다. 환자는 또한 다음 2주에 걸쳐 작성할 설사 일기와 함께 집으로 보내질 것입니다. 중증 위장염이 있는 아동을 식별한 후, 코호트 내에서 연령에 맞는 대조군(최근 위장염이 없음)을 가져와 비타민 A 및 혈청 아연 수치를 측정합니다. 위장염이 있는 어린이는 국가 지침(세계보건기구(WHO)의 소아기 질병 통합 관리)에 따라 치료를 받습니다. 위탁이 필요한 경우 아동은 외래 진료소로, 심각한 경우에는 대학 부속 병원으로 위탁됩니다.

연구 절차. 같은 상기와.

실험실 방법.

1. 로타바이러스 특이 IgA 및 IgG의 검출은 ELISA에 의해 발생합니다. 로타바이러스 특이적 IgA 및 IgG의 검출은 ELISA에 의해 발생합니다. 간단히 절차는 다음과 같습니다. 마이크로플레이트 웰(예: Nunc Immuno I)을 정제된 바이러스 항원 제제와 함께 배양한 다음 Tween 세제(PBS-T)와 함께 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 혈청 및 모유 샘플을 연속 희석하고(1% 소 혈청 알부민을 함유한 PBS-T에서) 코팅된 마이크로플레이트에서 37oC에서 2시간 동안 배양한 다음 4oC에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 마이크로플레이트를 세척하고 과산화효소 접합 항인간 IgA 또는 IgG 염소 항체(Sigma Immunochemicals)를 첨가합니다. 그런 다음 H2SO4로 반응을 종료하고 광학 밀도를 EIA 플레이트 판독기로 측정합니다. 모든 샘플은 각 바이러스 항원과 대조군 항원에 대해 이중으로 분석됩니다. 테스트 웰은 450nm에서의 광학 밀도에 의해 양성으로 간주되었습니다(예: 자체 제어의 2배 이상인 경우). 특이성은 샘플 없이 인큐베이션된 제어 항원을 포함하는 웰을 포함하여 제어되며 민감도는 특정 로타바이러스 특이적 면역글로불린 클래스의 높은 역가를 포함하는 것으로 알려진 샘플의 존재하에 인큐베이션된 바이러스 항원을 포함하는 웰을 포함하여 확인됩니다.
2. Rotavirus Antigen의 검출은 Rotaclone ELISA에 의해 발생합니다. 대변 ​​샘플은 제조업체의 사양에 따라 ELISA(Rotaclone®, Meridian Biosciences)에 의해 로타바이러스에 대해 테스트됩니다. 간단히 말해서, 샘플을 실온으로 가져오고 0.02% 티메로솔이 포함된 완충 식염수로 희석합니다. 희석된 샘플과 효소 접합체는 Rotaclone 마이크로플레이트 내에서 VP6 단백질에 대한 단일클론 항체와 함께 배양됩니다. 우레아 퍼옥사이드와 테트라메틸벤지딘을 포함하는 기질 완충액을 첨가하고 H2SO4로 반응을 종료합니다. 그런 다음 에어 블랭크에 대해 450nm에서 흡광도를 측정하여 분광광도계 결과를 결정합니다. 흡광도 단위(A450)가 0.150보다 큰 표본은 양성으로 간주됩니다. 흡광도가 0.150 이하인 것은 음성으로 간주됩니다.

3 Rotavirus VP7 유전자형의 결정. 제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzolTM Reagent(GIBCO Life Technologies)를 사용하여 PBS(pH 7.0)에 있는 로타바이러스 항원 양성 대변 물질의 10% 현탁액에서 바이러스 RNA를 추출합니다. 그런 다음 앞서 설명한 대로 RT-PCR을 통해 바이러스 RNA를 채취합니다.

추출된 바이러스 RNA는 바이러스 단백질 7(VP7)을 암호화하는 유전자 세그먼트 9 내의 두 바이러스 RNA 가닥의 3' 말단에 상보적인 프라이머를 사용하는 중첩된 PCR을 통해 취해집니다. 이 프라이머는 첫 번째 가닥 합성에 사용됩니다. 프라이머 RVG9 ​​및 6개의 혈청형 특이적 프라이머(aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 및 aFT9)는 유전자 9의 6개 가변 영역에 위치하며 G-혈청형 1, 2, 3, 4, 8 및 9에 해당합니다. , 두 번째 증폭에 사용됩니다. 간략하게 설명하면, 각 프라이머 Beg9 및 End9의 25pmol을 포함하는 5μl의 RNA를 97°C에서 5분 동안 변성시키고 얼음 위에서 냉각시킵니다. 그 후, 1.5 μl의 10X PCR 완충액(500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl(pH 8.3), 2 μl의 25 mM MgCl2, 2 μl의 2.5 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 10 U AMV 역전사효소(Promega) 및 20 U Rnasin ribonuclease 억제제(Promega)를 샘플-프라이머 혼합물에 첨가하고 42°C에서 60분 동안 배양합니다. 3.5µl의 10X PCR 완충액, 2µl의 2.5mM 복숭아 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 2.5U AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer) 및 27µl의 물을 포함하는 PCR 완충액 혼합물(35µl)을 RT 반응에 첨가합니다. 반응 혼합물을 94°C에서 3분 동안 변성시킨 후, 30 사이클(94°C에서 1분, 42°C에서 2분, 72°C에서 3분) 및 72°C에서 5분의 최종 확장 .

1차 PCR 산물(2μl)을 5μl의 10X PCR 완충액, 각 프라이머 aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 및 RVG9 ​​25pmol, 각 dATP 0.2mM을 포함하는 48μl의 두 번째 PCR 반응 혼합물로 옮깁니다. , dGTP, dCTP 및 dTTP, 2mM MgCl2, 2.5U의 Taq 중합효소. 2차 순환 조건은 25주기만 실행된다는 점을 제외하면 1차 순환과 동일합니다. 증폭된 VP7의 예상 길이를 확인하기 위해 PCR 산물을 겔 전기영동으로 분석하여 유전자형을 결정할 수 있습니다. 다른 프라이머 세트, PCR 조건 및/또는 시퀀싱은 초기 프라이머가 실패하는 경우 유전자형을 구별하는 데 사용됩니다.

4 VP4 유전자형 결정. 유전자 4의 PCR 타이핑 전략은 원칙적으로 VP7.64에 사용되는 것과 동일합니다. 첫 번째 가닥 합성(역전사)은 프라이머 Con2 및 Con3(박스 3)을 사용하여 VP4의 고도로 보존된 영역을 활용합니다. 유전자 세그먼트 4 내의 두 바이러스 RNA 가닥의 3' 말단. 1~5 μL의 바이러스 RNA를 최종 부피 8.5 μl의 3.5 μl 디메틸설폭사이드(Sigma)가 들어 있는 0.5 ml 마이크로원심분리기 튜브에 첨가하고 샘플을 혼합하고 97°C에서 5분간 변성. 그런 다음 샘플을 얼음 위에서 5분 동안 냉각하고 짧은 원심분리로 수집합니다. 13.5 μL의 H20, 16 μL의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 1.25 mM), 5 μL 1OX 버퍼(100 mM Tris-히드로클로라이드[pH 8.3], 500 mM KCl)(Perkin-Elmer Cetus), 3.5µL의 25mM MgCl2, 2µl의 프라이머(각 프라이머, Con 2 및 Con 3의 25µM 포함) 및 9U 역전사효소를 변성된 각 dsRNA 샘플 튜브에 추가합니다(최종 반응 부피 49µl 제공). ) 42oC에서 60분간 배양한다.

1 µL(1.9U)의 Taq polymerase와 100 µL의 mineral oil을 첨가한 후, 1차 PCR을 30주기(94oC에서 1분, 50oC에서 2분, 72oC에서 2분) 동안 수행합니다. 실험 완료 시 샘플을 170℃로 가져오기 위해 냉각 주기가 사용됩니다. 0.5~5µL의 1차 제품(보이는 제품이 없는 경우 5µL, 보이는 제품의 경우 0.5µL)을 사용하여 수행되는 경우 2차 타이핑 반응을 최종 부피 50µL의 45µL 반응 혼합물과 혼합합니다. 5 µL 미만의 첫 번째 라운드 제품이 추가되는 경우 50 µL를 완성하기 위한 나머지 부피는 10mM TrisHCl(pH 8.3)-2.5mM입니다. MgCl2. 반응 혼합물은 물 19.5µL, dNTPs 16µL, 10X 완충액 II 5µL, 25mM MgCl2 3µL, 프라이머 칵테일 1µL(Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, 및 4T-1) 및 0.5µL(2.5U) Taq. 샘플은 미네랄 오일로 오버레이되고 25회 PCR(첫 번째 라운드와 동일한 주기)을 통해 채취됩니다. 그런 다음 샘플을 겔 전기영동으로 분석하고 제품 크기를 통해 VP4 유전자형을 결정할 수 있습니다. 다른 프라이머 세트 및/또는 시퀀싱은 초기 프라이머가 실패하는 경우 유전자형을 구별하는 데 사용됩니다.

5 비타민 A 및 아연 수치 결정: 제조업체의 지침에 따라 ELISA(예: 인간 비타민 A, EIAAB)로 비타민 A 수치에 대해 혈청 샘플을 평가합니다. 간단히 말해서, 이 키트에 제공된 마이크로타이터 플레이트는 비타민 A에 특이적인 항체로 미리 코팅되어 있습니다. 표준물질 또는 샘플은 VA에 특이적인 비오틴이 결합된 다클론 항체 제제와 양고추냉이에 결합된 아비딘이 있는 적절한 마이크로타이터 플레이트 웰에 추가됩니다. 과산화효소(HRP)를 각 마이크로플레이트 웰에 첨가하고 배양합니다. 그런 다음 테트라메틸벤지딘 기질 용액을 각 웰에 첨가합니다. 비타민 A, 비오틴 결합 항체 및 효소 결합 Avidin을 포함하는 웰만 색상 변화를 나타냅니다. 효소-기질 반응은 H2SO4의 첨가에 의해 종료되고 색상 변화는 450nm의 파장에서 분광광도계로 측정됩니다. 그런 다음 샘플의 VA 농도는 O.D. 샘플을 표준 곡선으로

혈청 아연 농도를 측정하기 위해 크로모겐 4-(2-피리딜라조) 레조르시놀 나트륨 염과 함께 분광광도법을 사용하는 Lampugnani의 단순 비색법과 같은 분석법을 사용하여 혈액에서 아연 수치를 측정합니다.