Causas del fracaso de la vacuna contra el rotavirus en niños de Zambia

El estudio se llevará a cabo en el centro de salud de Kamwala en Lusaka, donde se encuentran las clínicas de salud maternoinfantil (MCH) y terapia antirretroviral (ART), así como la unidad de investigación de Kamwala del Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas de Zambia (CIDRZ). Kamwala tiene una población de captación de más de 10 000 con aproximadamente 30 nuevos bebés que se presentan a MCH cada mes con tasas de inmunización de 6 a 14 semanas (DPT-HiB-Hep) superiores al 95 %. El asistente de la clínica del estudio o el consejero de pares se acercarán a las parejas de madre e hijo durante la visita inicial a MCH con información sobre este estudio en el idioma local de su elección. Los interesados ​​en general serán invitados a la clínica de investigación que está cerca, para obtener información más detallada durante la cual la enfermera del estudio reclutará a las madres motivadas y las llevará a través del proceso de consentimiento informado por escrito. Para los participantes analfabetos, una persona alfabetizada e independiente presenciará y validará el proceso de consentimiento informado. Se mantendrá un registro específico para mostrar información sobre fechas y números de invitados al estudio, y se documentarán las razones de la negativa.

Un enfermero senior de investigación, un enfermero del estudio y un asistente de investigación clínica serán responsables del consentimiento informado y los procedimientos de inscripción bajo la supervisión del investigador. Un pediatra estará disponible para consultas prácticas cuando sea necesario.

Seguimiento de cohortes. Se les pedirá a las madres inscritas que completen cuestionarios demográficos y de comportamiento, un formulario de localización de participantes y que se sometan a flebotomía y extracción mecánica de leche materna en la visita de inscripción para la determinación de IgG e IgA antirrotavirus (en suero y leche materna). A los lactantes se les determinarán los anticuerpos IgA e IgG antirrotavirus de referencia para determinar la exposición inicial a la inmunoglobulina transplacentaria y de tipo salvaje, seguido de una segunda determinación de IgA sérica un mes después de completar la vacunación contra el rotavirus (aproximadamente a las 14-20 semanas).

Luego, se realizará un seguimiento trimestral de los bebés en la clínica durante el resto del estudio y también se realizarán visitas clínicas provisionales si el niño tiene diarrea. En cada visita, se pesará al niño, se medirá su altura y se tomarán datos antropométricos, incluido el pliegue cutáneo para la grasa corporal subcutánea y la circunferencia del brazo medio. Durante cualquier visita provisional sintomática, se realizarán evaluaciones de la gravedad de la enfermedad (mediante la escala de Vesikari) y se recolectará una muestra de heces para determinar el antígeno y el genotipo del rotavirus si el rotavirus es positivo. El paciente también será enviado a casa con un diario de diarrea que se completará durante las siguientes dos semanas. Después de la identificación de un niño con gastroenteritis grave, se traerá un control de la misma edad dentro de la cohorte (sin gastroenteritis reciente) para medir los niveles de vitamina A y zinc sérico. Los niños con gastroenteritis serán tratados de acuerdo con las pautas nacionales (según el Manejo integrado de enfermedades infantiles de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Si se requiere remisión, el niño será remitido a una clínica ambulatoria o, en casos graves, al Hospital Docente Universitario.

Procedimientos de estudio. Lo mismo que arriba.

Métodos de laboratorio.

1. La detección de IgA e IgG específicas de rotavirus se realizará mediante ELISA. La detección de IgA e IgG específicas de rotavirus se realizará mediante ELISA. Brevemente, el procedimiento es el siguiente. Los pocillos de las microplacas (p. ej., Nunc Immuno I) se incuban con preparaciones de antígenos virales purificados y luego se lavan con solución salina tamponada con fosfato con detergente Tween (PBS-T). Las muestras de suero y leche materna se diluyen en serie (en PBS-T que contiene albúmina de suero bovino al 1 %) y se incuban en las microplacas recubiertas durante 2 horas a 37 °C y luego durante la noche a 4 °C. A continuación, se lavan las microplacas y se añaden anticuerpos de cabra IgA o IgG antihumanos conjugados con peroxidasa (Sigma Immunochemicals). A continuación, la reacción se termina con H2SO4 y la densidad óptica se mide mediante un lector de placas EIA. Todas las muestras se analizan por duplicado frente a cada antígeno viral y frente a un antígeno de control. Un pozo de prueba se consideró positivo por su densidad óptica a 450 nm, por ejemplo, si es mayor o igual a dos veces la de su propio control. La especificidad se controla mediante la inclusión de pocillos que contienen antígeno de control incubado en ausencia de la muestra, y la sensibilidad se comprueba mediante la inclusión de pocillos que contienen antígeno viral incubado en presencia de muestras que se sabe que contienen títulos altos de una clase particular de inmunoglobulina específica contra rotavirus.
2. La detección del antígeno de rotavirus ocurrirá mediante Rotaclone ELISA. Las muestras de heces se analizarán para detectar rotavirus mediante ELISA (Rotaclone®, Meridian Biosciences) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Brevemente, la muestra se llevará a temperatura ambiente y se diluirá con solución salina tamponada con timerosol al 0,02 %. La muestra diluida y el conjugado enzimático se incuban luego con un anticuerpo monoclonal contra la proteína VP6 dentro de la microplaca Rotaclone. Luego se agregan tampones de sustrato que contienen peróxido de urea y tetrametilbencidina, y la reacción se termina con H2SO4. A continuación, se realiza la determinación espectrofotométrica del resultado midiendo la absorbancia a 450 nm frente a un blanco de aire. Las muestras con unidades de absorbancia (A450) superiores a 0,150 se consideran positivas. Aquellos con absorbancia igual o inferior a 0,150 se consideran negativos.

3 Determinación del Genotipo Rotavirus VP7. El ARN viral se extrae de una suspensión al 10 % de materia fecal positiva para el antígeno de rotavirus en PBS (pH 7,0) utilizando el reactivo TRIzolTM (GIBCO Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Luego, el ARN viral se toma a través de RT-PCR como se describió anteriormente.

Luego, el ARN viral extraído se toma a través de PCR anidada utilizando cebadores que son complementarios a los extremos 3' de ambas cadenas de ARN viral dentro del segmento 9 del gen, que codifica la proteína viral 7 (VP7). Estos cebadores se utilizan para la síntesis de la primera cadena. Cebador RVG9 ​​y seis cebadores específicos de serotipo (aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8 y aFT9) que se ubican en seis regiones variables en el gen 9 y corresponden a los serotipos G 1, 2, 3, 4, 8 y 9 , se utilizan en la segunda amplificación. Brevemente, se desnaturalizan 5 µl de ARN con 25 pmol de cada cebador Beg9 y End9 durante 5 min a 97°C y se enfrían en hielo. Posteriormente, 8 µl de la mezcla de reacción de RT que contiene 1,5 µl de tampón de PCR 10X (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM (pH 8,3), 2 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de 2,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y Se añade dTTP, 10 U de transcriptasa inversa AMV (Promega) y 20 U de inhibidor de ribonucleasa Rnasin (Promega) a la mezcla de muestra y cebador y se incuba a 42 °C durante 60 min. Mezcla de tampón de PCR (35 µl), que contiene 3,5 µl de tampón de PCR 10X, 2 µl de dATP, dCTP, dGTP y dTTP de durazno 2,5 mM, 2,5 U de polimerasa de ADN AmpliTaq (Perkin Elmer) y 27 µl de agua se añaden a la reacción de RT. La mezcla de reacción se desnaturaliza a 94°C durante 3 min, seguido de 30 ciclos (1 min a 94°C, 2 min a 42°C, 3 min a 72°C) y una extensión final de 5 min a 72°C .

Los productos de la primera ronda de PCR (2 µl) se transfieren a 48 µl de la mezcla de reacción de la segunda PCR, que contiene 5 µl de tampón de PCR 10X, 25 pmol de cada uno de los cebadores aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9 y RVG9, 0,2 mM de cada dATP , dGTP, dCTP y dTTP, MgCl _{2} 2 mM, 2,5 U de Taq polimerasa. Las condiciones de ciclismo de la segunda ronda son idénticas a las de la primera, excepto que solo se realizan 25 ciclos. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel para identificar las longitudes esperadas de VP7 amplificado, lo que permite la determinación del genotipo. Se utilizan otros conjuntos de cebadores, condiciones de PCR y/o secuenciación para distinguir el genotipo cuando/si fallan los cebadores iniciales.

4 Determinación del Genotipo VP4. La estrategia para la tipificación por PCR del gen 4 es idéntica, en principio, a la utilizada para VP7.64 La síntesis de la primera cadena (transcripción inversa) aprovecha las áreas altamente conservadas de VP4 utilizando los cebadores Con2 y Con3 (Cuadro 3), que son complementarios a los extremos 3' de ambas cadenas de ARN viral dentro del segmento génico 4. Se agregan de 1 a 5 µL de ARN viral a tubos de microcentrífuga de 0,5 ml que contienen 3,5 µl de dimetilsulfóxido (Sigma) en un volumen final de 8,5 µl, y las muestras se mezclan y desnaturalizado a 97°C durante 5 min. A continuación, las muestras se enfrían en hielo durante 5 min y se recogen mediante una breve centrifugación. 13,5 µL de H20, 16 µL de desoxinucleósido trifosfato (1,25 mM de cada dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 µL de tampón 1OX (clorhidrato de Tris 100 mM [pH 8,3], KCl 500 mM) (Perkin-Elmer Cetus), A continuación, se añaden 3,5 µL de MgCl2 25 mM, 2 µl de cebador (que contiene 25 µM de cada cebador, Con 2 y Con 3) y 9 U de transcriptasa inversa a cada tubo de muestra desRNA desnaturalizado (para dar un volumen de reacción final de 49 µl). ) y se incubó a 42oC durante 60 minutos.

Luego de agregar 1 µL (1.9U) de polimerasa Taq y 100 µL de aceite mineral, se lleva a cabo la primera ronda de PCR durante 30 ciclos (1 min a 94 °C, 2 min a 50 °C y 2 min a 72 °C). Se usa un ciclo de enfriamiento para llevar las muestras a 17°C al finalizar el experimento. La reacción de tipificación de segunda ronda, si se realiza con 0,5 a 5 µL del producto de primera ronda (5 µL si no hay producto visible; 0,5 µL si hay producto visible) se mezcla con 45 µL de mezcla de reacción en un volumen final de 50 µL. Si se agregan menos de 5 µL del producto de la primera ronda, el volumen restante, para completar los 50 µL, es TrisHCl 10 mM (pH 8,3)-2,5 mM MgCl¬2. La mezcla de reacción consta de 19,5 µL de agua, 16 µL de dNTP, 5 µL de tampón II 10X, 3 µL de MgCl2 25 mM, 1 µL del cóctel de cebadores (que contiene 20 µM de cada uno de Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, y 4T-1), y 0,5 µL (2,5U) Taq. Las muestras se cubren con aceite mineral y se someten a 25 rondas de PCR (los mismos ciclos que la primera ronda). Luego, las muestras se analizan mediante electroforesis en gel y el tamaño del producto permite la determinación del genotipo VP4. Se utilizan otros conjuntos de cebadores y/o secuenciación para distinguir el genotipo cuando/si fallan los cebadores iniciales.

5 Determinación de los niveles de vitamina A y zinc: las muestras de suero se evaluarán para determinar el nivel de vitamina A mediante ELISA (p. ej., vitamina A humana, EIAAB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la placa de microtitulación provista en este kit ha sido recubierta previamente con un anticuerpo específico para la vitamina A. Luego se agregan estándares o muestras a los pocillos de la placa de microtitulación apropiados con una preparación de anticuerpo policlonal conjugado con biotina específica para VA y avidina conjugada con rábano picante. Se añade peroxidasa (HRP) a cada pocillo de la microplaca y se incuba. Luego se agrega una solución de sustrato de tetrametilbencidina a cada pocillo. Solo los pocillos que contienen vitamina A, anticuerpo conjugado con biotina y avidina conjugada con enzima mostrarán un cambio de color. La reacción enzima-sustrato se termina con la adición de H2SO4 y el cambio de color se mide espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm. A continuación, se determina la concentración de VA en las muestras comparando la D.O. de las muestras a la curva estándar.

Los niveles de zinc se medirán en la sangre mediante ensayos como el método colorimétrico simple de Lampugnani, que utiliza un método espectrofotométrico con sal sódica de resorcinol cromógeno 4-(2-piridilazo) para medir las concentraciones séricas de zinc.