術後の急性および慢性疼痛に対するエピジェネティックな影響

(i) 被験者: 第三大臼歯の手術を受ける 60 人の被験者 (以下、「症例」といいます) は、クイーン メアリー病院およびプリンス フィリップ歯科病院から募集され、手術を受けない 60 人の高齢および性別が一致する対照者が集められます。今後 3 か月以内に手術を受けておらず、過去 1 年間に手術を受けていない患者（以下「対照」といいます）も、同じ病院の外来部門から募集されます。

(ii) 方法：各被験者に研究の目的と内容を説明し、同意を得ます。 私たちのグループが開発した痛み日記アンケートは、各被験者が手術前後に経験した痛みを評価するために応用されます。 研究担当者は各症例に同行し、訪問中に患者の血液を採取する際に痛み日記のアンケートに記入します。

募集対象者は、次の健康に関する質問に回答します。

SF-36: 機能的健康および幸福スコアの 8 段階プロファイル、および心理測定に基づく身体的および精神的健康の要約測定 HADS: 被験者の心理状態の評価 (不安とうつ病)

痛みの評価:

安静時および開口時の痛みは、以下の時点で数値評価スケール (NRS、1= 痛みなし、10 = 最も重度の痛み) を使用して評価されます。

1. 手術前
2. 16時間手術後4時間後
3. 術後24日目、48日目、72日目
4. 術後1ヶ月の電話インタビュー。
5. 術後3ヶ月の電話インタビュー。 痛みがある場合は、神経障害性疼痛についての質問が行われます。

各回の静脈EDTA血液(10ml)を、手術の1時間前、手術の1時間および3時間後に各症例から採取する。 その後、手術後 3 ～ 5 日後にもう一度採血するために病院に戻ってもらい、全細胞の半分から採血した後、できるだけ早くマクロファージを血液から分離し、トータル RNA を抽出します。 残りの細胞（マクロファージ）は-80℃で保存され、DNA抽出のためにバッチ処理されます。 静脈ＥＤＴＡ血液（２０ｍｌ）を各対照被験者から都合のよい時間に、最初の採血から３〜５日後に再度採取する。 対照被験者から採取した血液は、症例被験者から採取した血液とまったく同じ方法で処理されます。 したがって、各症例および対照被験者から合計 4 つのサンプルが取得されます。

転写開始部位の上流の配列および最初のエクソンの一部にわたる IL-6 および TNF-α プロモーター領域のサイズは、文献検索と参照用のデータベースを使用して決定され、最初に CpG アイランドが特定されます。プライマー設計 (http://www.cpgislands.com/)。 メチル化の分析には、市販のキットを使用します（ドイツ、ヒルデンの Qiagen 製 EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit）。

サンプルは亜硫酸水素塩変換を受け、メチル化されていないシトシンが脱アミノ化されてウラシルが形成されます。 メチル化されたシトシンは変化しません。 遺伝子配列のメチル化シトシンの位置とメチル化シトシンの量は、確立された技術を使用したパイロシーケンシングによって同定および定量されます。 結果は、IL-6 および NF-κB のプロモーター領域におけるメチル化率として表されます。

注: パイロシーケンス技術では、1 回の反応で最大 50 塩基対の DNA フラグメントのみを分析できます。 CpG Island Searcher のデータによると、% GC が 55% に設定され、観察された CpG/予想される CpG が 0.65 に設定され、隣接するアイランド間のギャップが 100 bp に設定された場合、IL-6 または IL-6 のいずれにも CpG アイランドは見つかりません。 TNFαプロモーター。 したがって、両方の遺伝子のプロモーター領域全体のメチル化状態を、各遺伝子に対して 40 対のプライマーを使用して研究します (プロモーター領域の 2 kb をカバーするため)。 このアプローチは、プロモーター領域などの拡張領域における部位特異的な DNA メチル化の決定に最も感度が高く、信頼性が高いため採用されています。

(iii) 研究デザイン: これは症例対照研究です。 この研究で使用されるサンプルは、症例から手術前および術後、および対照から同じ時間に採取された全血サンプルです。

検出力の計算: 正常な健康な被験者における IL-6 および TNF-α のプロモーター領域の DNA メチル化レベルに関するデータは存在しません。 検出力の計算により、各グループの 51 人の被験者が 5% の有意水準で対象変数の真の差異を検出するには 80% の検出力が必要であることがわかります (G*Power ソフトウェア、バージョン 3.1 を使用した計算)。 ドロップアウト率を考慮して、合計 60 人の被験者が各グループに募集されます。

(iv) データ処理および分析: 手術前後の DNA メチル化レベルの違いを調査するために、対応のある t 検定 (またはノンパラメトリック同等) が実行されます。 対応のない t 検定を使用して、症例と対照間の DNA メチル化レベルの違いを調査します。 相関分析は、メチル化状態と IL-6 および TNF-α 発現との関係を調査するために使用されます。 記述統計を使用して、IL-6およびTNF-αBのプロモーター領域のメチル化状態の変化（つまり、CpGアイランドの異なる部位がメチル化されているかどうか）、手術前後および2つの異なるサンプリング時間で説明します。対照被験者のポイント。

目的と可能性：これは、IL-6 および NF-κB のプロモーター領域における DNA メチル化変化に対する両側第三大臼歯手術の影響、および遺伝子発現に対するメチル化状態の影響に関するパイロット的かつ探索的な環境エピジェネティクス研究です。 この結果は、炎症遺伝子のメチル化状態が術後の痛みの経験に影響を与える可能性がある分子メカニズムへの洞察を提供し、理解を促進するでしょう。