Epigenetisk påvirkning på postkirurgisk akutt og kronisk smerte

(i) Emner: Seksti forsøkspersoner som skal gjennomgå tredje molar kirurgi (heretter kjent som "cases") vil bli rekruttert fra The Queen Mary Hospital og The Prince Philip Dental Hospital og seksti, alders- og kjønnsmatchede kontroller som ikke skal gjennomgå kirurgi i løpet av de neste 3 månedene, og heller ikke har gjennomgått operasjon det siste året (heretter kalt 'kontroller') vil også bli rekruttert fra poliklinisk avdeling på samme sykehus.

(ii) Metoder: Studiemålene og detaljene vil bli forklart for hvert forsøksperson og informert samtykke vil bli innhentet fra hver av dem. Et smertedagbok-spørreskjema utviklet av vår gruppe vil bli tilpasset for bruk for å vurdere smerte opplevd av hvert enkelt individ før og etter operasjonen. Forskningspersonell vil følge hvert enkelt saksobjekt, og fylle ut smertedagbokspørreskjemaet med dem under besøket når pasientens blod tas.

Følgende helsespørreskjemaer vil bli utfylt av fagpersonene som rekrutterer:

SF-36: 8-skala profil av funksjonell helse og velvære skårer samt psykometrisk-baserte fysiske og mentale helse oppsummerende tiltak HADS: Vurdering av den psykologiske statusen til forsøkspersonene (angst & depresjon)

Smertevurdering:

Smerter i hvile og under åpning vil bli vurdert ved hjelp av en numerisk vurderingsskala (NRS, 1 = ingen smerte, 10 = mest alvorlig smerte) på følgende tidspunkt:

1. Før operasjonen
2. 4 timer etter operasjonen i 16 timer
3. På 24., 48. og 72. etter operasjonen
4. 1 måned etter operasjon ved telefonintervju.
5. 3 måneder etter operasjon ved telefonintervju. Hvis smerte er tilstede, vil spørsmål om nevropatisk smerte bli stilt.

Venøst ​​EDTA-blod (10 ml) ved hver anledning vil bli tappet fra hvert tilfelle en time før operasjonen, 1 time og 3 timer etter operasjonen. Deretter vil de bli bedt om å returnere til sykehuset 3 til 5 dager etter operasjonen for en ny blodtaking, og makrofager vil bli separert fra blodet og totalt RNA vil bli ekstrahert så snart som mulig etter blodopptak fra halvparten av cellene. Resten av cellene (makrofager) vil bli lagret ved -80oC og batchet for DNA-ekstraksjon. Venøst ​​EDTA-blod (20 ml) vil bli tatt fra hver kontrollperson på et tidspunkt som passer dem og igjen, 3 til 5 dager etter første blodtaking. Blodet tatt fra kontrollpersonene vil bli behandlet på nøyaktig samme måte som med blod tatt fra casepersonene. Det vil derfor innhentes totalt fire prøver fra hver sak og kontrollperson.

Størrelsen på IL-6- og TNF-α-promoterregionene som spenner over sekvensene oppstrøms for det transkripsjonelle startstedet så vel som en del av det første eksonet vil bli bestemt fra litteratursøk og ved å bruke en database for referanse, vil CpG-øyene først identifiseres for primerdesign (http://www.cpgislands.com/). For analyse av metylering vil et kommersielt sett brukes (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit fra Qiagen, Hilden, Tyskland).

Prøver vil gjennomgå bisulfitt-omdannelse, og umetylerte cytosiner vil bli deaminert og danne uraciler. Metylerte cytosiner vil forbli uendret. Plasseringen av det metylerte cytosinet til gensekvensen og mengden av metylert cytosin vil bli identifisert og kvantifisert ved Pyrosequencing ved bruk av etablerte teknikker. Resultatene vil bli uttrykt som % metylering i promotorregionen til IL-6 og NF-ĸB.

Merk: Pyrosekvenseringsteknikken kan bare analysere fragmenter av DNA på opptil 50 basepar i én reaksjon. I følge data fra CpG Island Searcher, og når % GC ble satt til 55 %, observert CpG/forventet CpG satt til 0,65 og gap mellom tilstøtende øyer satt til 100bp, kan ingen CpG-øyer bli funnet i verken IL-6, eller TNFa-promotoren. Derfor vil metyleringsstatusen til hele promotorregionen i begge gener bli studert ved å bruke 40 par primere for hvert gen (for å dekke 2kb av promotorregionen). Denne tilnærmingen er tatt i bruk ettersom den er den mest sensitive og pålitelige for bestemmelse av stedsspesifikk DNA-metylering i en utvidet region som en promoterregion.

(iii) Studiedesign: Dette er en case-kontroll studie. Prøvene som brukes i denne studien vil være fullblodsprøver tatt før og etter kirurgi fra tilfellene, og på et matchende tidspunkt, fra kontrollene.

Kraftberegninger: Det finnes ingen data om nivået av DNA-metylering i promotorregionen til IL-6 og TNF-α hos normale friske forsøkspersoner. Effektberegninger viser at 51 forsøkspersoner i hver gruppe må ha 80 % kraft for å oppdage en sann forskjell i variabelen av interesse ved 5 % signifikansnivå (beregninger ved bruk av G*Power-programvare, versjon 3.1). Totalt 60 personer vil bli rekruttert til hver gruppe for å ta hensyn til frafallsrater.

(iv) Databehandling og analyse: Paret t-test (eller ikke-parametrisk ekvivalent) vil bli utført for å undersøke forskjeller i nivå av DNA-metylering før og etter kirurgi. Uparet t-test vil bli brukt for å undersøke forskjellen i nivået av DNA-metylering mellom tilfeller og kontroller. Korrelasjonsanalyse vil bli brukt for å undersøke sammenhenger mellom metyleringsstatus og IL-6 og TNF-α uttrykk. Beskrivende statistikk vil bli brukt for å beskrive endringene i metyleringsstatus (dvs. hvis forskjellige steder på CpG-øya er metylert) i promoterregionen til IL-6 og TNF-α B, før etter kirurgi og i de to forskjellige prøvetakingstidene punkter av kontrollfagene.

Formål og potensial: Dette er en pilot, utforskende miljø-epigenetisk studie på effekten av bilateral tredje molar kirurgi på DNA-metyleringsendringer i promotorregionen til IL-6 og NF-ĸB, og påvirkningen av metyleringsstatus på genuttrykk. Resultatene vil gi innsikt og fremme forståelse for de molekylære mekanismene som gjør at metyleringsstatusen til inflammatoriske gener kan påvirke opplevelsen av smerte etter kirurgi.