Epigenetiske påvirkninger på post-kirurgisk akutte og kroniske smerter

(i) Emner: Tres forsøgspersoner, der skal gennemgå en tredje molar kirurgi (herefter kendt som "cases"), vil blive rekrutteret fra The Queen Mary Hospital og The Prince Philip Dental Hospital og tres, alderen og kønsmatchede kontroller, som ikke vil blive opereret inden for de næste 3 måneder, og heller ikke er blevet opereret inden for det seneste år (herefter kaldet 'kontroller') også rekrutteres fra ambulatoriet på samme hospital.

(ii) Metoder: Undersøgelsens formål og detaljer vil blive forklaret for hvert forsøgsperson, og der vil blive indhentet informeret samtykke fra hver af dem. Et smertedagbogsspørgeskema udviklet af vores gruppe vil blive tilpasset til brug for vurdering af smerte oplevet af hvert enkelt individ før og efter operationen. Forskningspersonale vil ledsage hver enkelt sagsperson og udfylde smertedagbogsspørgeskemaet med dem under besøget, når patienternes blod tages.

Følgende sundhedsspørgeskemaer vil blive udfyldt af de ansatte, der rekrutterer:

SF-36: 8-skala profil af funktionel sundhed og velvære score samt psykometrisk baserede fysiske og mentale helbredsmæssige målinger HADS: Vurdering af forsøgspersonernes psykologiske status (angst & depression)

Smertevurdering:

Smerter i hvile og under åbning vil blive vurderet ved hjælp af en numerisk vurderingsskala (NRS, 1 = ingen smerter, 10 = mest alvorlige smerter) på følgende tidspunkter:

1. Før operationen
2. 4 timer efter operationen i 16 timer
3. 24., 48. og 72. efter operationen
4. 1 måned efter operationen ved telefonsamtale.
5. 3 måneder efter operationen ved telefonsamtale. Hvis der er smerter, vil der blive stillet spørgsmål om neuropatisk smerte.

Venøst ​​EDTA-blod (10 ml) ved hver lejlighed vil blive udtaget fra hvert tilfælde en time før operationen, 1 time og 3 timer efter operationen. Derefter vil de blive bedt om at vende tilbage til hospitalet 3 til 5 dage efter operationen for endnu en blodtagning, og makrofager vil blive adskilt fra blodet, og total RNA vil blive ekstraheret så hurtigt som muligt efter blodtagning fra halvdelen af ​​det samlede antal celler. Resten af ​​cellerne (makrofager) vil blive opbevaret ved -80oC og batchet til DNA-ekstraktion. Venøst ​​EDTA-blod (20 ml) vil blive udtaget fra hver kontrolperson på et tidspunkt, der er passende for dem, og igen 3 til 5 dage efter første blodtagning. Blodet taget fra kontrolpersonerne vil blive behandlet på nøjagtig samme måde som med blod taget fra casepersonerne. Derfor vil der blive indhentet fire prøver i alt fra hver case og kontrolperson.

Størrelsen af ​​IL-6- og TNF-α-promotorregionerne, der spænder over sekvenserne opstrøms for det transkriptionelle startsted såvel som en del af det første exon, vil blive bestemt ud fra litteratursøgning og ved hjælp af en database til reference, vil CpG-øer først blive identificeret for primer design (http://www.cpgislands.com/). Til analyse af methylering vil et kommercielt kit blive brugt (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit fra Qiagen, Hilden, Tyskland).

Prøver vil gennemgå bisulfit-omdannelse, og umethylerede cytosiner vil blive deamineret og danne uraciler. Methylerede cytosiner forbliver uændrede. Placeringen af ​​det methylerede cytosin af gensekvensen og mængden af ​​methyleret cytosin vil blive identificeret og kvantificeret ved Pyrosequencing ved brug af etablerede teknikker. Resultater vil blive udtrykt som % methylering i promotorregionen af ​​IL-6 og NF-ĸB.

Bemærk: Pyrosekventeringsteknikken kan kun analysere fragmenter af DNA på op til 50 basepar i én reaktion. Ifølge data fra CpG Island Searcher, og når % GC blev sat til 55%, observeret CpG/forventet CpG sat til 0,65 og mellemrum mellem tilstødende øer sat til 100bp, kan der ikke findes nogen CpG øer i hverken IL-6 eller TNFa-promotoren. Derfor vil methyleringsstatus for hele promotorregionen i begge gener blive undersøgt under anvendelse af 40 par primere for hvert gen (for at dække 2 kb af promotorregionen). Denne fremgangsmåde er vedtaget, da den er den mest følsomme og pålidelige til bestemmelse af stedspecifik DNA-methylering i en udvidet region, såsom en promotorregion.

(iii) Undersøgelsesdesign: Dette er en case-kontrol undersøgelse. Prøverne, der anvendes i denne undersøgelse, vil være fuldblodsprøver taget før og efter operationen fra tilfældene og på et afstemt tidspunkt fra kontrollerne.

Effektberegninger: Der eksisterer ingen data om niveauet af DNA-methylering i promotorregionen af ​​IL-6 og TNF-α hos normale raske forsøgspersoner. Effektberegninger afslører, at 51 forsøgspersoner i hver gruppe skal have 80 % effekt for at detektere en sand forskel i den interessante variabel på 5 % signifikansniveau (beregninger ved hjælp af G*Power-software, version 3.1). I alt 60 forsøgspersoner vil blive rekrutteret til hver gruppe for at tage højde for frafaldsprocenter.

(iv) Databehandling og analyse: Parret t-test (eller ikke-parametrisk ækvivalent) vil blive udført for at undersøge forskelle i niveauet af DNA-methylering før og efter operation. Ikke-parret t-test vil blive brugt til at undersøge forskellen i niveauet af DNA-methylering mellem tilfælde og kontroller. Korrelationsanalyse vil blive brugt til at undersøge sammenhænge mellem methyleringsstatus og IL-6 og TNF-α ekspression. Beskrivende statistik vil blive brugt til at beskrive ændringerne i methyleringsstatus (dvs. hvis forskellige steder i CpG-øen er methyleret) i promotorregionen af ​​IL-6 og TNF-α B, før efter kirurgi og i de to forskellige prøveudtagningstider kontrolfagenes punkter.

Formål og potentiale: Dette er en pilot, eksplorativ miljø-epigenetisk undersøgelse af effekten af ​​bilateral tredje molær kirurgi på DNA-methyleringsændringer i promotorregionen af ​​IL-6 og NF-ĸB, og indflydelsen af ​​methyleringsstatus på genekspression. Resultaterne vil give indsigt og fremme forståelsen af ​​de molekylære mekanismer, hvorigennem inflammatoriske geners methyleringsstatus kan påvirke oplevelsen af ​​smerte efter operationen.