Epigenetische Einflüsse auf postoperative akute und chronische Schmerzen

(i) Probanden: Sechzig Probanden, die sich einer dritten Molarenoperation unterziehen werden (im Folgenden als „Fälle“ bezeichnet), werden aus dem Queen Mary Hospital und dem Prince Philip Dental Hospital rekrutiert sowie sechzig alters- und geschlechtsangepasste Kontrollpersonen, die sich keiner Operation unterziehen Patienten, die in den nächsten drei Monaten behandelt werden oder sich im letzten Jahr einer Operation unterzogen haben (im Folgenden als „Kontrollen“ bezeichnet), werden ebenfalls aus der Ambulanz desselben Krankenhauses rekrutiert.

(ii) Methoden: Die Studienziele und -details werden jedem Probanden erklärt und es wird von jedem eine Einverständniserklärung eingeholt. Ein von unserer Gruppe entwickelter Schmerztagebuch-Fragebogen wird für die Beurteilung der Schmerzen angepasst, die jeder Proband vor und nach der Operation verspürt. Das Forschungspersonal wird jeden Fallpatienten begleiten und während des Besuchs, bei dem den Patienten Blut entnommen wird, den Schmerztagebuch-Fragebogen mit ihnen ausfüllen.

Die folgenden Gesundheitsfragebögen werden von den rekrutierten Probanden ausgefüllt:

SF-36: 8-Skalen-Profil der funktionellen Gesundheits- und Wohlbefindenswerte sowie psychometrisch basierte zusammenfassende Maßnahmen zur körperlichen und geistigen Gesundheit. HADS: Beurteilung des psychologischen Status der Probanden (Angstzustände und Depressionen).

Schmerzbeurteilung:

Schmerzen in Ruhe und beim Öffnen werden anhand einer numerischen Bewertungsskala (NRS, 1 = keine Schmerzen, 10 = stärkste Schmerzen) zu folgenden Zeitpunkten bewertet:

1. Vor der Operation
2. 4 Stunden nach der Operation für 16 Stunden
3. Am 24., 48. und 72. nach der Operation
4. 1 Monat nach der Operation per Telefoninterview.
5. 3 Monate nach der Operation per Telefoninterview. Wenn Schmerzen vorhanden sind, werden Fragen zu neuropathischen Schmerzen gestellt.

Venöses EDTA-Blut (10 ml) wird jeweils eine Stunde vor der Operation, 1 Stunde und 3 Stunden nach der Operation entnommen. Dann werden sie gebeten, 3 bis 5 Tage nach der Operation für eine weitere Blutentnahme ins Krankenhaus zurückzukehren, und Makrophagen werden vom Blut getrennt und die Gesamt-RNA wird so schnell wie möglich nach der Blutentnahme aus der Hälfte aller Zellen extrahiert. Der Rest der Zellen (Makrophagen) wird bei -80 °C gelagert und für die DNA-Extraktion portioniert. Venöses EDTA-Blut (20 ml) wird von jeder Kontrollperson zu einem für sie passenden Zeitpunkt und erneut 3 bis 5 Tage nach der ersten Blutentnahme entnommen. Das den Kontrollpersonen entnommene Blut wird genauso behandelt wie das den Fallpersonen entnommene Blut. Daher werden von jedem Fall und jeder Kontrollperson insgesamt vier Proben entnommen.

Die Größe der IL-6- und TNF-α-Promotorregionen, die sich über die Sequenzen stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle sowie einen Teil des ersten Exons erstrecken, wird durch Literaturrecherche und unter Verwendung einer Datenbank als Referenz bestimmt, wobei zunächst CpG-Inseln identifiziert werden Primer-Design (http://www.cpgislands.com/). Zur Analyse der Methylierung wird ein kommerzielles Kit verwendet (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit von Qiagen, Hilden, Deutschland).

Die Proben werden einer Bisulfit-Umwandlung unterzogen und nicht methylierte Cytosine werden desaminiert, wodurch Uracile entstehen. Methylierte Cytosine bleiben unverändert. Der Ort des methylierten Cytosins in der Gensequenz und die Menge an methyliertem Cytosin werden durch Pyrosequenzierung unter Verwendung etablierter Techniken identifiziert und quantifiziert. Die Ergebnisse werden als % Methylierung in der Promotorregion von IL-6 und NF-ĸB ausgedrückt.

Hinweis: Mit der Pyrosequenzierungstechnik können nur DNA-Fragmente mit bis zu 50 Basenpaaren in einer Reaktion analysiert werden. Laut Daten von CpG Island Searcher und wenn der % GC auf 55 %, das beobachtete CpG/erwartete CpG auf 0,65 und die Lücken zwischen benachbarten Inseln auf 100 bp eingestellt wurden, können weder im IL-6 noch CpG-Inseln gefunden werden der TNFα-Promotor. Daher wird der Methylierungsstatus der gesamten Promotorregion in beiden Genen unter Verwendung von 40 Primerpaaren für jedes Gen untersucht (um 2 kb der Promotorregion abzudecken). Dieser Ansatz wird gewählt, da er für die Bestimmung der ortsspezifischen DNA-Methylierung in einer ausgedehnten Region wie einer Promotorregion am empfindlichsten und zuverlässigsten ist.

(iii) Studiendesign: Dies ist eine Fall-Kontroll-Studie. Bei den in dieser Studie verwendeten Proben handelt es sich um Vollblutproben, die den Fällen vor und nach der Operation und zu einem passenden Zeitpunkt den Kontrollpersonen entnommen werden.

Leistungsberechnungen: Es liegen keine Daten zum Grad der DNA-Methylierung in der Promotorregion von IL-6 und TNF-α bei normalen gesunden Probanden vor. Power-Berechnungen zeigen, dass 51 Probanden in jeder Gruppe eine Power von 80 % haben müssen, um einen echten Unterschied in der interessierenden Variablen bei einem Signifikanzniveau von 5 % zu erkennen (Berechnungen mit der G*Power-Software, Version 3.1). Insgesamt werden 60 Probanden in jede Gruppe aufgenommen, um die Abbrecherquoten zu berücksichtigen.

(iv) Datenverarbeitung und -analyse: Ein gepaarter t-Test (oder ein nichtparametrisches Äquivalent) wird durchgeführt, um Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung vor und nach der Operation zu untersuchen. Der ungepaarte T-Test wird verwendet, um Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung zwischen Fällen und Kontrollen zu untersuchen. Mithilfe einer Korrelationsanalyse werden Zusammenhänge zwischen dem Methylierungsstatus und der IL-6- und TNF-α-Expression untersucht. Beschreibende Statistiken werden verwendet, um die Änderungen im Methylierungsstatus (d. h. ob verschiedene Stellen auf der CpG-Insel methyliert sind) in der Promotorregion von IL-6 und TNF-α B vor der Operation und in den beiden unterschiedlichen Probenahmezeiten zu beschreiben Punkte der Kontrollpersonen.

Zweck und Potenzial: Hierbei handelt es sich um eine explorative Umweltepigenetik-Pilotstudie über die Auswirkung bilateraler Eingriffe am dritten Molaren auf DNA-Methylierungsänderungen in der Promotorregion von IL-6 und NF-ĸB sowie den Einfluss des Methylierungsstatus auf die Genexpression. Die Ergebnisse werden Einblicke liefern und das Verständnis für die molekularen Mechanismen fördern, durch die der Methylierungsstatus von Entzündungsgenen das Schmerzempfinden nach einer Operation beeinflussen kann.