Wpływy epigenetyczne na ostry i przewlekły ból pooperacyjny

(i) Pacjenci: Sześćdziesięciu pacjentów, którzy będą przechodzić operację trzeciego zęba trzonowego (zwanych dalej „przypadkami”), zostanie zrekrutowanych ze szpitali Queen Mary Hospital i The Prince Philip Dental Hospital oraz sześćdziesięciu osób z grupy kontrolnej dobranej pod względem wieku i płci, które nie będą poddawane zabiegom chirurgicznym w ciągu najbliższych 3 miesięcy, którzy nie przeszli operacji w ciągu ostatniego roku (zwani dalej „grupą kontrolną”) będą również rekrutowani z oddziału ambulatoryjnego tego samego szpitala.

(ii) Metody: Cele i szczegóły badania zostaną wyjaśnione każdemu uczestnikowi i od każdego z nich zostanie poproszona o świadomą zgodę. Opracowany przez naszą grupę kwestionariusz bólu zostanie dostosowany do oceny bólu odczuwanego przez każdego pacjenta przed i po operacji. Personel badawczy będzie towarzyszył każdemu pacjentowi i wypełnił z nim kwestionariusz bólu podczas wizyty, podczas której pobierana jest krew od pacjentów.

Rekrutowani będą wypełniać następujące kwestionariusze zdrowotne:

SF-36: 8-skalowy profil oceny zdrowia funkcjonalnego i samopoczucia, a także oparte na psychometrii sumaryczne pomiary zdrowia fizycznego i psychicznego HADS: Ocena stanu psychicznego badanych (lęk i depresja)

Ocena bólu:

Ból w spoczynku i podczas otwierania będzie oceniany przy użyciu numerycznej skali oceny (NRS, 1=brak bólu, 10=najsilniejszy ból) w następujących punktach czasowych:

1. Przed operacją
2. 4 godziny po operacji przez 16 godzin
3. W 24, 48 i 72 dniu po operacji
4. 1 miesiąc po zabiegu w rozmowie telefonicznej.
5. 3 miesiące po zabiegu w rozmowie telefonicznej. Jeśli ból jest obecny, zostaną zadane pytania dotyczące bólu neuropatycznego.

Krew żylna EDTA (10 ml) będzie każdorazowo pobierana z każdego przypadku na godzinę przed operacją, 1 godzinę i 3 godziny po operacji. Następnie zostaną poproszeni o powrót do szpitala 3 do 5 dni po operacji na jeszcze jedno pobranie krwi, a makrofagi zostaną oddzielone od krwi i całkowity RNA zostanie wyekstrahowany tak szybko, jak to możliwe po pobraniu krwi z połowy wszystkich komórek. Pozostała część komórek (makrofagi) będzie przechowywana w -80oC i porcjowana do ekstrakcji DNA. Krew żylna EDTA (20 ml) zostanie pobrana od każdego osobnika kontrolnego w dogodnym dla niego czasie i ponownie, 3 do 5 dni po pierwszym pobraniu krwi. Krew pobrana od osób kontrolnych będzie traktowana dokładnie w taki sam sposób jak krew pobrana od osób badanych. W związku z tym od każdego przypadku i podmiotu kontrolnego zostaną pobrane łącznie cztery próbki.

Wielkość regionów promotorowych IL-6 i TNF-α obejmujących sekwencje w górę od miejsca startu transkrypcji, jak również część pierwszego eksonu zostanie określona na podstawie wyszukiwania literatury i przy użyciu bazy danych jako odniesienia, wyspy CpG zostaną najpierw zidentyfikowane dla projekt podkładu (http://www.cpgislands.com/). Do analizy metylacji zostanie użyty dostępny w handlu zestaw (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit firmy Qiagen, Hilden, Niemcy).

Próbki ulegną przemianie wodorosiarczynowej, a niezmetylowane cytozyny ulegną deaminacji, tworząc uracyle. Metylowane cytozyny pozostaną niezmienione. Lokalizacja zmetylowanej cytozyny w sekwencji genu i ilość zmetylowanej cytozyny zostaną zidentyfikowane i ocenione ilościowo przez pirosekwencjonowanie przy użyciu ustalonych technik. Wyniki zostaną wyrażone jako % metylacji w regionie promotorowym IL-6 i NF-ĸB.

Uwaga: Technika pirosekwencjonowania umożliwia analizę tylko fragmentów DNA o długości do 50 par zasad w jednej reakcji. Według danych CpG Island Searcher, kiedy % GC ustalono na 55%, obserwowane CpG/oczekiwane CpG ustalono na 0,65, a przerwy między sąsiednimi wyspami ustalono na 100 pz, nie można było znaleźć wysp CpG ani w IL-6, ani promotor TNFα. Dlatego stan metylacji całego regionu promotora w obu genach będzie badany przy użyciu 40 par starterów dla każdego genu (w celu pokrycia 2 kb regionu promotora). Podejście to przyjęto, ponieważ jest najbardziej czułe i niezawodne do określania specyficznej dla miejsca metylacji DNA w rozszerzonym regionie, takim jak region promotora.

(iii) Projekt badania: Jest to badanie kliniczno-kontrolne. Próbki użyte w tym badaniu będą próbkami krwi pełnej pobranej przed i po operacji od pacjentów iw odpowiednim czasie od osób kontrolnych.

Obliczenia mocy: Brak danych na temat poziomu metylacji DNA w regionie promotora IL-6 i TNF-α u zdrowych osób. Obliczenia mocy pokazują, że 51 osób w każdej grupie musi mieć moc 80%, aby wykryć prawdziwą różnicę w zmiennej będącej przedmiotem zainteresowania na poziomie istotności 5% (obliczenia przy użyciu oprogramowania G*Power, wersja 3.1). W sumie 60 osób zostanie zrekrutowanych do każdej grupy, aby wziąć pod uwagę wskaźniki rezygnacji.

(iv) Przetwarzanie i analiza danych: Sparowany test t (lub nieparametryczny odpowiednik) zostanie przeprowadzony w celu zbadania różnic w poziomie metylacji DNA przed i po operacji. Niesparowany test t zostanie wykorzystany do zbadania różnic w poziomie metylacji DNA między przypadkami a kontrolami. Analiza korelacji zostanie wykorzystana do zbadania zależności między statusem metylacji a ekspresją IL-6 i TNF-α. Statystyki opisowe zostaną wykorzystane do opisania zmian w stanie metylacji (tj. czy różne miejsca na wyspie CpG są metylowane) w regionie promotora IL-6 i TNF-α B, przed operacją po zabiegu i w dwóch różnych czasach pobierania próbek punkty obiektów kontrolnych.

Cel i potencjał: Jest to pilotażowe, eksploracyjne badanie środowiskowo-epigenetyczne dotyczące wpływu obustronnej operacji trzeciego trzonowca na zmiany metylacji DNA w regionie promotora IL-6 i NF-ĸB oraz wpływu statusu metylacji na ekspresję genów. Wyniki zapewnią wgląd i przyczynią się do zrozumienia mechanizmów molekularnych, poprzez które stan metylacji genów zapalnych może wpływać na odczuwanie bólu po operacji.