Influences épigénétiques sur la douleur aiguë et chronique post-chirurgicale

(i) Sujets : Soixante sujets qui subiront une chirurgie de la troisième molaire (ci-après appelés « cas ») seront recrutés à l'hôpital Queen Mary et à l'hôpital dentaire Prince Philip et soixante témoins appariés d'âge et de sexe qui ne subiront pas de chirurgie. au cours des 3 prochains mois, ni n'ayant subi d'intervention chirurgicale au cours de l'année écoulée (ci-après dénommés « contrôles ») seront également recrutés dans le service de consultation externe du même hôpital.

(ii) Méthodes : les objectifs et les détails de l'étude seront expliqués à chaque sujet et un consentement éclairé sera demandé à chacun d'entre eux. Un questionnaire de journal de la douleur développé par notre groupe sera adapté pour l'évaluation de la douleur ressentie par chaque sujet avant et après la chirurgie. Le personnel de recherche accompagnera chaque sujet de cas et remplira avec lui le questionnaire du journal de la douleur lors de la visite lors de la prise de sang des patients.

Les questionnaires de santé suivants seront remplis par les sujets recrutés :

SF-36 : Profil en 8 échelles des scores de santé fonctionnelle et de bien-être ainsi que des mesures sommaires de santé physique et mentale basées sur la psychométrie HADS : Évaluation de l'état psychologique des sujets (anxiété et dépression)

Évaluation de la douleur :

La douleur au repos et lors de l'ouverture sera évaluée à l'aide d'une échelle d'évaluation numérique (NRS, 1 = pas de douleur, 10 = douleur la plus intense) aux moments suivants :

1. Avant la chirurgie
2. 4 heures après la chirurgie pendant 16 heures
3. Aux 24e, 48e et 72e après la chirurgie
4. 1 mois après la chirurgie par entretien téléphonique.
5. 3 mois après l'intervention par entretien téléphonique. Si la douleur est présente, des questions sur la douleur neuropathique seront posées.

Du sang veineux EDTA (10 ml) sera prélevé à chaque occasion sur chaque cas une heure avant la chirurgie, 1 heure et 3 heures après la chirurgie. Ensuite, il leur sera demandé de retourner à l'hôpital 3 à 5 jours après la chirurgie pour une autre prise de sang, et les macrophages seront séparés du sang et l'ARN total sera extrait dès que possible après la prise de sang de la moitié des cellules totales. Le reste des cellules (macrophages) sera stocké à -80 oC et mis en lots pour l'extraction de l'ADN. Du sang veineux EDTA (20 ml) sera prélevé sur chaque sujet témoin à un moment qui leur convient et à nouveau, 3 à 5 jours après la première prise de sang. Le sang prélevé sur les sujets témoins sera traité exactement de la même manière que le sang prélevé sur les sujets cas. Par conséquent, quatre échantillons au total seront obtenus de chaque cas et sujet témoin.

La taille des régions promotrices de l'IL-6 et du TNF-α couvrant les séquences en amont du site d'initiation de la transcription ainsi qu'une partie du premier exon sera déterminée à partir d'une recherche documentaire et à l'aide d'une base de données de référence, les îlots CpG seront d'abord identifiés pour conception de l'amorce (http://www.cpgislands.com/). Pour l'analyse de la méthylation, un kit commercial sera utilisé (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit de Qiagen, Hilden, Allemagne).

Les échantillons subiront une conversion au bisulfite et les cytosines non méthylées seront désaminées, formant des uraciles. Les cytosines méthylées resteront inchangées. L'emplacement de la cytosine méthylée de la séquence du gène et la quantité de cytosine méthylée seront identifiés et quantifiés par pyroséquençage à l'aide de techniques établies. Les résultats seront exprimés en % de méthylation dans la région promotrice de l'IL-6 et du NF-ĸB.

Remarque : La technique de pyroséquençage ne peut analyser que des fragments d'ADN jusqu'à 50 paires de bases en une seule réaction. Selon les données de CpG Island Searcher, et lorsque le % GC a été fixé à 55 %, le CpG observé/CpG attendu fixé à 0,65 et les écarts entre les îles adjacentes fixés à 100 pb, aucun îlot CpG ne peut être trouvé dans l'IL-6, ou le promoteur TNFα. Par conséquent, le statut de méthylation de l'ensemble de la région promotrice dans les deux gènes sera étudié à l'aide de 40 paires d'amorces pour chaque gène (afin de couvrir 2 kb de la région promotrice). Cette approche est adoptée car elle est la plus sensible et la plus fiable pour la détermination de la méthylation de l'ADN spécifique au site dans une région étendue telle qu'une région promotrice.

(iii) Conception de l'étude : Il s'agit d'une étude cas-témoin. Les échantillons utilisés dans cette étude seront des échantillons de sang total prélevés avant et après l'opération chez les cas et, à un moment correspondant, chez les témoins.

Calculs de puissance : Aucune donnée n'existe sur le niveau de méthylation de l'ADN dans la région promotrice de l'IL-6 et du TNF-α chez des sujets sains normaux. Les calculs de puissance révèlent que 51 sujets dans chaque groupe doivent avoir une puissance de 80 % pour détecter une vraie différence dans la variable d'intérêt à un niveau de signification de 5 % (calculs à l'aide du logiciel G*Power, version 3.1). Un total de 60 sujets seront recrutés dans chaque groupe pour tenir compte des taux d'abandon.

(iv) Traitement et analyse des données : un test t apparié (ou un équivalent non paramétrique) sera effectué pour étudier les différences de niveau de méthylation de l'ADN avant et après la chirurgie. Un test t non apparié sera utilisé pour étudier la différence de niveau de méthylation de l'ADN entre les cas et les témoins. L'analyse corrélationnelle sera utilisée pour étudier les relations entre le statut de méthylation et l'expression de l'IL-6 et du TNF-α. Des statistiques descriptives seront utilisées pour décrire les changements dans l'état de méthylation (c'est-à-dire si différents sites de l'îlot CpG sont méthylés) dans la région promotrice de l'IL-6 et du TNF-α B, avant et après la chirurgie et dans les deux temps d'échantillonnage différents. points des sujets témoins.

Objectif et potentiel : Il s'agit d'une étude pilote d'épigénétique environnementale exploratoire sur l'effet de la chirurgie bilatérale de la troisième molaire sur les changements de méthylation de l'ADN dans la région promotrice de l'IL-6 et du NF-ĸB, et l'influence du statut de méthylation sur l'expression des gènes. Les résultats fourniront un aperçu et favoriseront la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l'état de méthylation des gènes inflammatoires peut affecter l'expérience de la douleur après la chirurgie.