Epigenetische invloeden op postoperatieve acute en chronische pijn

(i) Proefpersonen: Zestig proefpersonen die een derde molaaroperatie zullen ondergaan (hierna 'cases' genoemd) zullen worden gerekruteerd uit het Queen Mary Hospital en het Prince Philip Dental Hospital en zestig leeftijds- en geslachtsafhankelijke controles die geen operatie zullen ondergaan in de komende 3 maanden, noch in het afgelopen jaar een operatie hebben ondergaan (hierna 'controles' genoemd) worden eveneens geworven op de afdeling Poliklinieken van hetzelfde ziekenhuis.

(ii) Methoden: De onderzoeksdoelen en details zullen aan elke proefpersoon worden uitgelegd en van elk van hen zal geïnformeerde toestemming worden gevraagd. Een pijndagboekvragenlijst ontwikkeld door onze groep zal worden aangepast voor het gebruik van het beoordelen van de pijn die elke proefpersoon vóór en na de operatie ervaart. Onderzoekspersoneel zal elke casus begeleiden en samen met hen de pijndagboekvragenlijst invullen tijdens het bezoek wanneer het bloed van de patiënt wordt afgenomen.

De volgende gezondheidsvragenlijsten zullen worden ingevuld door de proefpersonen die worden geworven:

SF-36: 8-schaalprofiel van functionele gezondheids- en welzijnsscores, evenals op psychometrie gebaseerde samenvattende metingen van fysieke en mentale gezondheid HADS: beoordeling van de psychologische status van de proefpersonen (angst en depressie)

Pijn beoordeling:

Pijn in rust en tijdens openen wordt beoordeeld met behulp van een numerieke beoordelingsschaal (NRS, 1= geen pijn, 10 = zeer ernstige pijn) op de volgende tijdstippen:

1. Voor de operatie
2. 4 uur na de operatie gedurende 16 uur
3. Op 24, 48 en 72 na de operatie
4. 1 maand na operatie telefonisch interview.
5. 3 maand na operatie telefonisch interview. Als er pijn aanwezig is, zullen vragen over neuropathische pijn worden gesteld.

Veneus EDTA-bloed (10 ml) wordt bij elke gelegenheid een uur vóór de operatie, 1 uur en 3 uur na de operatie uit elk geval afgenomen. Daarna zal hen worden gevraagd om 3 tot 5 dagen na de operatie terug te keren naar het ziekenhuis voor nog een bloedafname, en macrofagen zullen worden gescheiden van het bloed en totaal RNA zal zo snel mogelijk worden geëxtraheerd na bloedafname van de helft van de totale cellen. De rest van de cellen (macrofagen) worden bij -80oC bewaard en in batches verdeeld voor DNA-extractie. Veneus EDTA-bloed (20 ml) zal bij elke controlepersoon worden afgenomen op een tijdstip dat hen uitkomt en nogmaals, 3 tot 5 dagen na de eerste bloedafname. Het bloed dat van de controlepersonen wordt afgenomen, wordt op precies dezelfde manier behandeld als het bloed dat van de proefpersonen wordt afgenomen. Daarom zullen er in totaal vier monsters worden genomen van elke casus en controlepersoon.

De grootte van de IL-6- en TNF-α-promoterregio's die de sequenties stroomopwaarts van de transcriptionele startplaats en een deel van het eerste exon overspannen, zal worden bepaald op basis van literatuuronderzoek en met behulp van een database ter referentie, zullen eerst CpG-eilanden worden geïdentificeerd voor primerontwerp (http://www.cpgislands.com/). Voor analyse van methylering zal een commerciële kit worden gebruikt (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit van Qiagen, Hilden, Duitsland).

Monsters ondergaan bisulfiet-conversie en niet-gemethyleerde cytosines worden gedeamineerd, waardoor uracils worden gevormd. Gemethyleerde cytosines blijven ongewijzigd. De locatie van het gemethyleerde cytosine van de gensequentie en de hoeveelheid gemethyleerd cytosine zullen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd door pyrosequencing met behulp van gevestigde technieken. De resultaten worden uitgedrukt als % methylering in het promotorgebied van IL-6 en NF-ĸB.

Opmerking: de pyrosequencing-techniek kan alleen DNA-fragmenten van maximaal 50 basenparen in één reactie analyseren. Volgens gegevens van CpG Island Searcher, en wanneer het % GC was ingesteld op 55%, waargenomen CpG/verwachte CpG ingesteld op 0,65 en openingen tussen aangrenzende eilanden ingesteld op 100 bp, kunnen er geen CpG-eilanden worden gevonden in de IL-6, of de TNFa-promotor. Daarom zal de methyleringsstatus van het hele promotorgebied in beide genen bestudeerd worden met behulp van 40 paar primers voor elk gen (om 2kb van het promotorgebied te dekken). Deze benadering wordt toegepast omdat deze de meest gevoelige en betrouwbare is voor het bepalen van plaatsspecifieke DNA-methylatie in een uitgestrekt gebied zoals een promotorgebied.

(iii) Onderzoeksopzet: dit is een case-control studie. De monsters die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn volbloedmonsters die voor en na de operatie zijn genomen van de casussen en op een gepast tijdstip van de controles.

Vermogensberekeningen: Er zijn geen gegevens beschikbaar over het niveau van DNA-methylatie in het promotorgebied van IL-6 en TNF-α bij normale gezonde proefpersonen. Uit powerberekeningen blijkt dat 51 proefpersonen in elke groep een power van 80% nodig hebben om een ​​echt verschil in de variabele van belang te detecteren op een significantieniveau van 5% (berekeningen met G*Power-software, versie 3.1). In elke groep zullen in totaal 60 proefpersonen worden gerekruteerd om rekening te houden met de uitvalpercentages.

(iv) Gegevensverwerking en -analyse: Gepaarde t-test (of niet-parametrisch equivalent) zal worden uitgevoerd om verschillen in niveau van DNA-methylatie voor en na de operatie te onderzoeken. Ongepaarde t-test zal worden gebruikt om het verschil in het niveau van DNA-methylatie tussen gevallen en controles te onderzoeken. Correlationele analyse zal gebruikt worden om relaties tussen methylatiestatus en IL-6 en TNF-α expressie te onderzoeken. Er zullen beschrijvende statistieken worden gebruikt om de veranderingen in de methyleringsstatus te beschrijven (d.w.z. als verschillende plaatsen op het CpG-eiland zijn gemethyleerd) in het promotorgebied van IL-6 en TNF-α B, pre-postoperatief en in de twee verschillende bemonsteringstijdstippen punten van de controlepersonen.

Doel en potentieel: Dit is een pilot, verkennend milieu-epigenetisch onderzoek naar het effect van bilaterale derde molaarchirurgie op DNA-methylatieveranderingen in het promotorgebied van IL-6 en NF-ĸB, en de invloed van de methylatiestatus op genexpressie. De resultaten zullen inzicht verschaffen en begrip bevorderen in de moleculaire mechanismen waardoor de methylatiestatus van ontstekingsgenen de ervaring van pijn na een operatie kan beïnvloeden.