Эпигенетические влияния на послеоперационную острую и хроническую боль

(i) Субъекты: Шестьдесят субъектов, которым будет проведена операция на третьем моляре (далее именуемые «случаи»), будут набраны из больницы Королевы Марии и Стоматологической больницы принца Филиппа, а также шестьдесят человек того же возраста и пола в контрольной группе, которые не будут подвергаться хирургическому вмешательству. в течение следующих 3 месяцев, а также те, кто не подвергался хирургическому вмешательству в прошлом году (далее именуемые «контрольная группа»), также будут набраны из амбулаторного отделения той же больницы.

(ii) Методы: цели и детали исследования будут объяснены каждому субъекту, и у каждого из них будет запрошено информированное согласие. Анкета дневника боли, разработанная нашей группой, будет адаптирована для оценки боли, испытываемой каждым субъектом до и после операции. Исследовательский персонал будет сопровождать каждого испытуемого и заполнять анкету дневника боли во время визита, когда у пациентов берут кровь.

Набранные испытуемые заполняют следующие анкеты о состоянии здоровья:

SF-36: профиль функционального здоровья и благополучия по 8 шкалам, а также сводные показатели физического и психического здоровья на основе психометрии HADS: оценка психологического статуса субъектов (тревога и депрессия)

Оценка боли:

Боль в покое и при вскрытии будет оцениваться с использованием числовой шкалы оценки (NRS, 1 = отсутствие боли, 10 = наиболее сильная боль) в следующие моменты времени:

1. До операции
2. через 4 часа после операции в течение 16 часов
3. На 24-м, 48-м и 72-м после операции
4. Через 1 месяц после операции по телефону.
5. Через 3 месяца после операции по телефону. Если присутствует боль, будут заданы вопросы о невропатической боли.

Венозная кровь с ЭДТА (10 мл) будет взята из каждого случая за один час до операции, через 1 час и через 3 часа после операции. Затем их попросят вернуться в больницу через 3-5 дней после операции для еще одного взятия крови, и макрофаги будут выделены из крови, а общая РНК будет извлечена как можно скорее после взятия крови из половины всех клеток. Остальные клетки (макрофаги) будут храниться при температуре -80°C и собираться для выделения ДНК. Венозная кровь с ЭДТА (20 мл) будет взята у каждого контрольного субъекта в удобное для них время и снова через 3-5 дней после первого взятия крови. С кровью, взятой у контрольных субъектов, будут обращаться точно так же, как с кровью, взятой у исследуемых субъектов. Таким образом, всего будет получено четыре образца от каждого случая и контрольного субъекта.

Размер промоторных областей IL-6 и TNF-α, охватывающих последовательности, расположенные выше сайта начала транскрипции, а также часть первого экзона, будет определен из литературного поиска и с использованием базы данных для справки, CpG-островки будут сначала идентифицированы для дизайн праймера (http://www.cpgislands.com/). Для анализа метилирования будет использоваться коммерческий набор (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit от Qiagen, Hilden, Germany).

Образцы подвергаются бисульфитной конверсии, а неметилированные цитозины дезаминируются с образованием урацилов. Метилированные цитозины останутся неизменными. Расположение метилированного цитозина в последовательности гена и количество метилированного цитозина будут идентифицированы и количественно оценены с помощью пиросеквенирования с использованием установленных методов. Результаты будут выражены в виде % метилирования в промоторной области IL-6 и NF-ĸB.

Примечание. Метод пиросеквенирования позволяет анализировать только фрагменты ДНК длиной до 50 пар оснований в одной реакции. Согласно данным CpG Island Searcher, когда % GC был установлен на 55%, наблюдаемый CpG/ожидаемый CpG установлен на 0,65, а промежутки между соседними островками установлены на 100 пар оснований, CpG-островки не могут быть обнаружены ни в IL-6, ни в промотор TNFα. Следовательно, статус метилирования всей промоторной области в обоих генах будет изучаться с использованием 40 пар праймеров для каждого гена (чтобы покрыть 2 т.п.о. промоторной области). Этот подход принят, поскольку он является наиболее чувствительным и надежным для определения сайт-специфического метилирования ДНК в расширенной области, такой как промоторная область.

(iii) Дизайн исследования: это исследование случай-контроль. Образцы, используемые в этом исследовании, будут представлять собой образцы цельной крови, взятые до и после операции у пациентов, а также в соответствующее время у контрольной группы.

Расчеты мощности: Нет данных об уровне метилирования ДНК в промоторной области IL-6 и TNF-α у нормальных здоровых субъектов. Расчеты мощности показывают, что 51 субъект в каждой группе должен иметь мощность 80% для обнаружения истинной разницы в интересующей переменной при уровне значимости 5% (расчеты с использованием программного обеспечения G*Power, версия 3.1). Всего в каждую группу будет набрано 60 человек с учетом показателей отсева.

(iv) Обработка и анализ данных. Будет проведен парный t-критерий (или непараметрический эквивалент) для изучения различий в уровне метилирования ДНК до и после операции. Непарный t-критерий будет использоваться для изучения различий в уровне метилирования ДНК между случаями и контролем. Корреляционный анализ будет использоваться для изучения связи между статусом метилирования и экспрессией IL-6 и TNF-α. Описательная статистика будет использоваться для описания изменений в статусе метилирования (т. е. если метилированы разные сайты в CpG-островке) в промоторной области IL-6 и TNF-α B, до операции и в два разных периода времени. точки субъектов управления.

Цель и потенциал: Это пилотное, исследовательское экологическое и эпигенетическое исследование влияния двусторонней хирургии третьего моляра на изменения метилирования ДНК в промоторной области IL-6 и NF-ĸB, а также влияние статуса метилирования на экспрессию генов. Результаты предоставят информацию и будут способствовать пониманию молекулярных механизмов, с помощью которых статус метилирования воспалительных генов может влиять на ощущение боли после операции.