Epigenetiska influenser på postkirurgisk akut och kronisk smärta

(i) Ämnen: Sextio försökspersoner som kommer att genomgå en tredje molar operation (nedan kallade "fall") kommer att rekryteras från The Queen Mary Hospital och The Prince Philip Dental Hospital och sextio, ålders- och könsmatchade kontroller som inte kommer att genomgå operation under de kommande 3 månaderna, och inte heller har genomgått operation under det senaste året (hädanefter känd som "kontroller") kommer också att rekryteras från polikliniken på samma sjukhus.

(ii) Metoder: Studiens syfte och detaljer kommer att förklaras för varje försöksperson och informerat samtycke kommer att begäras från var och en av dem. Ett frågeformulär för smärtdagbok som utvecklats av vår grupp kommer att anpassas för användning för att bedöma smärta som upplevs av varje patient före och efter operationen. Forskarpersonal kommer att följa med varje patient och fylla i smärtdagboken med dem under besöket när patientens blod tas.

Följande hälsofrågeformulär kommer att fyllas i av försökspersonerna som rekryterar:

SF-36: 8-skala profil av funktionell hälsa och välbefinnande poäng samt psykometriskt baserade fysiska och mentala hälsosammanfattningsmått HADS: Bedömning av försökspersonernas psykologiska status (ångest & depression)

Smärtbedömning:

Smärta i vila och under öppning kommer att bedömas med hjälp av en numerisk betygsskala (NRS, 1 = ingen smärta, 10 = svåraste smärtan) vid följande tidpunkter:

1. Innan operation
2. 4 timmar efter operationen i 16 timmar
3. På 24:e, 48:e och 72:e efter operationen
4. 1 månad efter operation via telefonintervju.
5. 3 månader efter operationen genom telefonintervju. Om smärta förekommer kommer frågor om neuropatisk smärta att ställas.

Venöst EDTA-blod (10 ml) vid varje tillfälle tas från varje fall en timme före operationen, 1 timme och 3 timmar efter operationen. Sedan kommer de att bli ombedda att återvända till sjukhuset 3 till 5 dagar efter operationen för ytterligare en blodtagning, och makrofager kommer att separeras från blodet och totalt RNA kommer att extraheras så snart som möjligt efter att ha tagit blod från hälften av det totala antalet celler. Återstoden av cellerna (makrofager) kommer att lagras vid -80oC och batchas för DNA-extraktion. Venöst EDTA-blod (20 ml) kommer att tas från varje kontrollperson vid en tidpunkt som är lämplig för dem och igen, 3 till 5 dagar efter första blodtagningen. Blodet som tas från kontrollpersonerna kommer att behandlas på exakt samma sätt som med blod som tas från patienterna. Därför kommer totalt fyra prover att erhållas från varje fall och kontrollämne.

Storleken på IL-6- och TNF-a-promotorregionerna som spänner över sekvenserna uppströms om det transkriptionella startstället såväl som en del av det första exonet kommer att bestämmas från litteratursökning och med hjälp av en databas som referens, kommer CpG-öar först att identifieras för primer design (http://www.cpgislands.com/). För analys av metylering kommer ett kommersiellt kit att användas (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit från Qiagen, Hilden, Tyskland).

Proverna kommer att genomgå bisulfitomvandling och ometylerade cytosiner kommer att deamineras och bilda uraciler. Metylerade cytosiner kommer att förbli oförändrade. Placeringen av det metylerade cytosinet i gensekvensen och mängden metylerat cytosin kommer att identifieras och kvantifieras genom Pyrosequencing med användning av etablerade tekniker. Resultaten kommer att uttryckas som % metylering i promotorregionen av IL-6 och NF-ĸB.

Obs: Pyrosekvenseringstekniken kan endast analysera fragment av DNA på upp till 50 baspar i en reaktion. Enligt data från CpG Island Searcher, och när % GC sattes till 55 %, observerat CpG/förväntat CpG satt till 0,65 och gap mellan intilliggande öar satt till 100 bp, kan inga CpG-öar hittas i varken IL-6, eller TNFa-promotorn. Därför kommer metyleringsstatusen för hela promotorregionen i båda generna att studeras med användning av 40 par primrar för varje gen (för att täcka 2 kb av promotorregionen). Detta tillvägagångssätt används eftersom det är det mest känsliga och tillförlitliga för bestämning av platsspecifik DNA-metylering i en utökad region såsom en promotorregion.

(iii) Studiedesign: Detta är en fall-kontrollstudie. Proverna som används i denna studie kommer att vara helblodsprover som tagits före och efter operationen från fallen och vid en matchad tidpunkt från kontrollerna.

Effektberäkningar: Det finns inga data om nivån av DNA-metylering i promotorregionen av IL-6 och TNF-α hos normala friska försökspersoner. Effektberäkningar avslöjar att 51 försökspersoner i varje grupp måste ha 80 % kraft för att upptäcka en sann skillnad i variabeln av intresse vid 5 % signifikansnivå (beräkningar med G*Power-programvara, version 3.1). Totalt 60 försökspersoner kommer att rekryteras till varje grupp för att ta hänsyn till avhoppsfrekvensen.

(iv) Databehandling och analys: Parat t-test (eller icke-parametrisk ekvivalent) kommer att utföras för att undersöka skillnader i nivå av DNA-metylering före och efter operation. Oparat t-test kommer att användas för att undersöka skillnaden i nivån av DNA-metylering mellan fall och kontroller. Korrelationsanalys kommer att användas för att undersöka samband mellan metyleringsstatus och IL-6- och TNF-α-uttryck. Beskrivande statistik kommer att användas för att beskriva förändringarna i metyleringsstatus (dvs om olika ställen på CpG-ön är metylerade) i promotorregionen av IL-6 och TNF-α B, före efter kirurgi och i de två olika provtagningstiderna kontrollämnenas punkter.

Syfte och potential: Detta är en pilot, explorativ miljö-epigenetikstudie om effekten av bilateral tredje molar kirurgi på DNA-metyleringsförändringar i promotorregionen av IL-6 och NF-ĸB, och inverkan av metyleringsstatus på genuttryck. Resultaten kommer att ge insikt och främja förståelse för de molekylära mekanismer genom vilka inflammatoriska geners metyleringsstatus kan påverka upplevelsen av smärta efter operation.