Epigeneettiset vaikutukset leikkauksen jälkeiseen akuuttiin ja krooniseen kipuun

(i) Koehenkilöt: Kuusikymmentä henkilöä, joille tehdään kolmas poskileikkaus (jäljempänä 'tapaukset'), rekrytoidaan Queen Mary -sairaalasta ja Prince Philip -hammassairaalasta sekä kuusikymmentä, ikää ja sukupuolta vastaavaa verrokkia, joille ei tehdä leikkausta. seuraavien 3 kuukauden aikana, eikä niille ole tehty leikkausta viimeisen vuoden aikana (jäljempänä 'kontrollit'), rekrytoidaan myös saman sairaalan avohoitoosastolta.

(ii) Menetelmät: Tutkimuksen tavoitteet ja yksityiskohdat selitetään kullekin tutkittavalle ja heiltä pyydetään tietoinen suostumus. Ryhmämme kehittämä kipupäiväkirjakysely mukautetaan kunkin koehenkilön ennen leikkausta ja sen jälkeen kokeman kivun arviointiin. Tutkimushenkilöstö seuraa jokaista tapauskohdetta ja täyttää kanssaan kipupäiväkirjakyselyn käynnin aikana, kun potilailta otetaan verta.

Rekrytoitavat täyttävät seuraavat terveyskyselyt:

SF-36: 8-asteikon profiili toiminnallisen terveyden ja hyvinvoinnin pisteistä sekä psykometrisesti perustuvat fyysisen ja mielenterveyden yhteenvetomitat HADS: Tutkittavien psykologisen tilan arviointi (ahdistus ja masennus)

Kivun arviointi:

Kipu levossa ja avaamisen aikana arvioidaan numeerisen luokitusasteikon avulla (NRS, 1 = ei kipua, 10 = pahin kipu) seuraavina ajankohtina:

1. Ennen leikkausta
2. 4 tunnin välein leikkauksen jälkeen 16 tunnin ajan
3. 24., 48. ja 72. leikkauksen jälkeen
4. 1 kk leikkauksen jälkeen puhelinhaastattelulla.
5. 3 kuukautta leikkauksen jälkeen puhelinhaastattelulla. Jos kipua esiintyy, neuropaattista kipua koskevia kysymyksiä kysytään.

Laskimo-EDTA-verta (10 ml) otetaan jokaisessa tapauksessa jokaisesta tapauksesta tuntia ennen leikkausta, 1 tunti ja 3 tuntia leikkauksen jälkeen. Sitten heitä pyydetään palaamaan sairaalaan 3–5 päivää leikkauksen jälkeen ottamaan vielä yksi verenotto, ja makrofagit erotetaan verestä ja kokonais-RNA eristetään mahdollisimman pian sen jälkeen, kun puolet kaikista soluista on otettu verta. Loput soluista (makrofagit) varastoidaan -80 oC:ssa ja eristetään DNA-uuttoa varten. Laskimo-EDTA-verta (20 ml) otetaan jokaiselta kontrollihenkilöltä hänelle sopivana ajankohtana ja uudelleen 3-5 päivää ensimmäisen verenoton jälkeen. Kontrollihenkilöiltä otettua verta käsitellään täsmälleen samalla tavalla kuin tapauskohteista otettua verta. Siksi kustakin tapauksesta ja kontrollikohteesta otetaan yhteensä neljä näytettä.

IL-6- ja TNF-a-promoottorialueiden koko, joka kattaa sekvenssit ylävirtaan transkription aloituskohdasta sekä osa ensimmäisestä eksonista, määritetään kirjallisuuden haun perusteella ja käyttämällä tietokantaa viitteenä, CpG-saaret tunnistetaan ensin pohjamaalisuunnittelu (http://www.cpgislands.com/). Metylaation analysointiin käytetään kaupallista pakkausta (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit, Qiagen, Hilden, Saksa).

Näytteet käyvät läpi bisulfiittikonversion ja metyloimattomat sytosiinit deaminoidaan muodostaen urasiileja. Metyloidut sytosiinit pysyvät ennallaan. Geenisekvenssin metyloidun sytosiinin sijainti ja metyloidun sytosiinin määrä tunnistetaan ja kvantifioidaan pyrosekvensoinnilla käyttäen vakiintuneita tekniikoita. Tulokset ilmaistaan ​​metylaatioprosentteina IL-6:n ja NF-ĸB:n promoottorialueella.

Huomautus: Pyrosekvensointitekniikka voi analysoida vain enintään 50 emäsparin DNA-fragmentteja yhdessä reaktiossa. CpG Island Searcherin tietojen mukaan ja kun % GC oli asetettu arvoon 55 %, havaittu CpG/odotettu CpG asetettu arvoon 0,65 ja vierekkäisten saarekkeiden väliset aukot asetettu arvoon 100 bp, CpG-saarekkeita ei löydy IL-6:sta tai TNFa-promoottori. Siksi koko promoottorialueen metylaatiotilaa molemmissa geeneissä tutkitaan käyttämällä 40 alukeparia jokaiselle geenille (jotta katetaan 2 kb promoottorialuetta). Tämä lähestymistapa on omaksuttu, koska se on herkin ja luotettavin määritettäessä kohtaspesifinen DNA-metylaatio pidennetyllä alueella, kuten promoottorialueella.

(iii) Tutkimuksen suunnittelu: Tämä on tapaus-verrokkitutkimus. Tässä tutkimuksessa käytetyt näytteet ovat kokoverinäytteitä, jotka on otettu ennen ja jälkeen leikkausta tapauksista ja sovitettuna ajankohtana kontrolleista.

Teholaskelmat: DNA-metylaation tasosta IL-6:n ja TNF-a:n promoottorialueella ei ole tietoa normaaleilla terveillä koehenkilöillä. Teholaskelmat paljastavat, että 51 koehenkilöllä kussakin ryhmässä vaaditaan 80 %:n teho havaitakseen todellinen ero kiinnostavassa muuttujassa 5 %:n merkitsevyystasolla (laskelmat G*Power-ohjelmistolla, versio 3.1). Jokaiseen ryhmään rekrytoidaan yhteensä 60 koehenkilöä keskeyttämisasteiden huomioon ottamiseksi.

(iv) Tietojen käsittely ja analyysi: Parillinen t-testi (tai ei-parametrinen ekvivalentti) suoritetaan DNA-metylaatiotason erojen tutkimiseksi ennen leikkausta ja sen jälkeen. Parittoman t-testin avulla tutkitaan eroja DNA-metylaatiotasossa tapausten ja kontrollien välillä. Korrelaatioanalyysiä käytetään metylaatiostatuksen sekä IL-6:n ja TNF-a:n ilmentymisen välisten suhteiden tutkimiseen. Kuvaavia tilastoja käytetään kuvaamaan metylaatiotilan muutoksia (eli jos CpG-saaren eri kohdat metyloituvat) IL-6:n ja TNF-α B:n promoottorialueella, ennen leikkausta ja kahdessa eri näytteenottoajassa kontrollikohteiden pisteitä.

Tarkoitus ja potentiaali: Tämä on pilottitutkimus ympäristö-epigeneettistä tutkimusta kahdenvälisen kolmannen molaarisen leikkauksen vaikutuksesta DNA:n metylaatiomuutoksiin IL-6:n ja NF-ĸB:n promoottorialueella sekä metylaatiotilan vaikutuksesta geenien ilmentymiseen. Tulokset antavat käsityksen ja edistävät ymmärrystä molekyylimekanismeista, joiden kautta tulehdusgeenien metylaatiostatus voi vaikuttaa leikkauksen jälkeiseen kipukokemukseen.