Epigenetikai hatások a műtét utáni akut és krónikus fájdalomra

(i) Alanyok: Hatvan olyan alanyt, akiken harmadik őrlőműtéten fognak átesni (a továbbiakban: esetek), a The Queen Mary Kórházból és a The Prince Philip Fogászati ​​Kórházból, valamint hatvan korú és nemű kontrollszemélyt vesznek fel, akiket nem operálnak. a következő 3 hónapban, illetve az elmúlt évben sebészeti beavatkozásokon (a továbbiakban: „kontrollok”) szintén ugyanannak a kórháznak a járóbeteg osztályáról lesznek felvéve.

(ii) Módszerek: A vizsgálat céljait és részleteit minden alanynak elmagyarázzák, és mindegyiküktől tájékozott beleegyezést kell kérni. A csoportunk által kidolgozott fájdalomnapló kérdőívet adaptálunk az egyes alanyok műtét előtti és utáni fájdalmának felmérésére. A vizsgálat során a kutatók elkísérik az egyes eseteket, és kitöltik velük a fájdalomnapló kérdőívet a vizit során, amikor a betegek vérvételét végzik.

A következő egészségügyi kérdőíveket töltik ki a toborzott alanyok:

SF-36: A funkcionális egészségi és jólléti pontszámok 8 skálájú profilja, valamint pszichometriai alapú fizikai és mentális egészség összefoglaló mérőszámok HADS: Az alanyok pszichológiai állapotának felmérése (szorongás és depresszió)

Fájdalom értékelése:

A nyugalmi és a nyitás közbeni fájdalmat egy numerikus értékelési skála segítségével kell értékelni (NRS, 1 = nincs fájdalom, 10 = a legsúlyosabb fájdalom) a következő időpontokban:

1. Műtét előtt
2. 4 óránként a műtét után 16 órán keresztül
3. 24., 48. és 72. műtét után
4. 1 hónappal a műtét után telefonos interjúval.
5. 3 hónappal a műtét után telefonos interjúval. Ha fájdalom jelentkezik, kérdéseket tesznek fel a neuropátiás fájdalommal kapcsolatban.

Minden alkalommal vénás EDTA vért (10 ml) vesznek minden esetben egy órával a műtét előtt, 1 órával és 3 órával a műtét után. Ezután megkérik őket, hogy térjenek vissza a kórházba a műtét után 3-5 nappal egy újabb vérvételre, és a makrofágokat elválasztják a vérből, és a teljes RNS-t a lehető leghamarabb kivonják, miután vért vettek az összes sejt feléből. A fennmaradó sejteket (makrofágokat) -80 oC-on tároljuk, és a DNS-kivonáshoz szakaszosan tároljuk. Vénás EDTA vért (20 ml) vesznek minden egyes kontroll alanytól a számukra megfelelő időpontban, majd 3-5 nappal az első vérvétel után. A kontroll alanyoktól vett vért pontosan ugyanúgy kezeljük, mint az eseti alanyoktól vett vért. Ezért minden esetből és kontroll alanyból összesen négy mintát veszünk.

Az IL-6 és a TNF-α promóter régiók méretét, amelyek a transzkripciós starthely előtti szekvenciákat, valamint az első exon egy részét felölelik, szakirodalmi keresés alapján határozzák meg, és referenciaként egy adatbázis segítségével először azonosítják a CpG szigeteket. primer design (http://www.cpgislands.com/). A metiláció elemzéséhez egy kereskedelmi készletet (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit, Qiagen, Hilden, Németország) használunk.

A minták biszulfit-konverzión mennek keresztül, és a metilálatlan citozinok dezaminálódnak, és uracilok keletkeznek. A metilezett citozinok változatlanok maradnak. A génszekvencia metilált citozinjának helyét és a metilált citozin mennyiségét piroszekvenálás segítségével azonosítjuk és mennyiségileg meghatározzuk, bevált technikák alkalmazásával. Az eredményeket %-os metilációban fejezzük ki az IL-6 és az NF-ĸB promoter régiójában.

Megjegyzés: A piroszekvenálási technika egy reakcióban legfeljebb 50 bázispárból álló DNS-fragmenseket képes elemezni. A CpG Island Searcher adatai szerint, és amikor a %-os GC-t 55%-ra állítottuk, a megfigyelt CpG/várt CpG értéket 0,65-re és a szomszédos szigetek közötti hézagokat 100 bp-ra állítottuk be, akkor sem az IL-6-ban, sem a a TNFα promoter. Ezért a teljes promóterrégió metilációs állapotát mindkét génben 40 pár láncindítóval vizsgáljuk minden génhez (a promoter régió 2 kb-jának lefedése érdekében). Ezt a megközelítést alkalmazzák, mivel ez a legérzékenyebb és legmegbízhatóbb a helyspecifikus DNS-metiláció meghatározására kiterjesztett régióban, például promóterrégióban.

(iii) A vizsgálat felépítése: Ez egy eset-kontroll vizsgálat. A vizsgálatban használt minták teljes vérminták, amelyeket a műtét előtt és után vettek az esetekből, és egy megfelelő időpontban a kontrollokból.

Teljesítményszámítások: Nincs adat az IL-6 és a TNF-α promoter régiójában a DNS-metiláció szintjéről normál egészséges alanyokban. A teljesítményszámítások azt mutatják, hogy minden csoportban 51 alanynak 80%-os teljesítményre van szüksége ahhoz, hogy 5%-os szignifikanciaszinten észlelje az érdeklődésre számot tartó változó valódi különbségét (számítások a G*Power szoftverrel, 3.1-es verzió). Minden csoportba összesen 60 alanyt vesznek fel, hogy figyelembe vegyék a lemorzsolódási arányt.

(iv) Adatfeldolgozás és -elemzés: Páros t-próbát (vagy nem paraméteres ekvivalenst) kell végezni a DNS-metiláció mértékében mutatkozó különbségek vizsgálatára a műtét előtt és után. Páratlan t-tesztet használunk az esetek és a kontrollok közötti DNS-metiláció szintjében mutatkozó különbségek vizsgálatára. A metilációs állapot, valamint az IL-6 és a TNF-α expressziója közötti összefüggések vizsgálatára korrelációs analízist alkalmazunk. Leíró statisztikákat alkalmazunk a metilációs állapot változásainak leírására (vagyis ha a CpG sziget különböző helyei metilálódnak) az IL-6 és a TNF-α B promoter régiójában, a műtét előtt és a két különböző mintavételi időben a kontroll alanyok pontjait.

Cél és lehetőség: Ez egy kísérleti, feltáró környezet-epigenetikai tanulmány a kétoldali harmadik moláris műtét hatásáról az IL-6 és az NF-ĸB promoter régiójában bekövetkező DNS metilációs változásokra, valamint a metilációs állapot hatásáról a génexpresszióra. Az eredmények betekintést nyújtanak és elősegítik azoknak a molekuláris mechanizmusoknak a megértését, amelyeken keresztül a gyulladásos gének metilációs állapota befolyásolhatja a műtét utáni fájdalom élményét.