Epigenetické vlivy na akutní a chronickou pooperační bolest

(i) Subjekty: Šedesát subjektů, které podstoupí operaci třetího moláru (dále označované jako „případy“), bude přijato z nemocnice Queen Mary Hospital a The Prince Philip Dental Hospital a šedesát kontrolních osob odpovídajících věku a pohlaví, které nepodstoupí operaci. v příštích 3 měsících, ani neprodělali operaci v minulém roce (dále jen „kontroly“) budou také přijati z ambulantního oddělení téže nemocnice.

(ii) Metody: Každému subjektu budou vysvětleny cíle a podrobnosti studie a od každého z nich bude požadován informovaný souhlas. Dotazník bolesti vyvinutý naší skupinou bude přizpůsoben pro použití k hodnocení bolesti, kterou každý subjekt pociťuje před a po operaci. Výzkumný personál bude doprovázet každý subjekt případu a během návštěvy, kdy je pacientům odebrána krev, s nimi vyplní dotazník o bolesti.

Rekrutovaní subjekty vyplní následující zdravotní dotazníky:

SF-36: 8stupňový profil skóre funkčního zdraví a pohody a také psychometricky založená souhrnná měření fyzického a duševního zdraví HADS: Posouzení psychického stavu subjektů (úzkost a deprese)

Hodnocení bolesti:

Bolest v klidu a během otevírání bude hodnocena pomocí číselné hodnotící stupnice (NRS, 1 = žádná bolest, 10 = nejsilnější bolest) v následujících časových bodech:

1. Před operací
2. 4 hodiny po operaci po dobu 16 hodin
3. Ve 24, 48 a 72 po operaci
4. 1 měsíc po operaci telefonicky.
5. 3 měsíce po operaci telefonicky. Pokud je přítomna bolest, budou položeny otázky týkající se neuropatické bolesti.

Venózní EDTA krev (10 ml) bude při každé příležitosti odebrána z každého případu hodinu před operací, 1 hodinu a 3 hodiny po operaci. Poté budou požádáni, aby se vrátili do nemocnice 3 až 5 dnů po operaci k dalšímu odběru krve a makrofágy budou separovány z krve a celková RNA bude extrahována co nejdříve po odběru krve z poloviny všech buněk. Zbytek buněk (makrofágů) bude skladován při -80oC a dávkován pro extrakci DNA. Každému kontrolnímu subjektu bude odebrána venózní krev EDTA (20 ml) ve vhodném čase a znovu, 3 až 5 dnů po prvním odběru krve. S krví odebranou kontrolním subjektům bude zacházeno přesně stejným způsobem jako s krví odebranou subjektům s případem. Od každého případu a kontrolního subjektu tedy budou získány celkem čtyři vzorky.

Velikost oblastí promotoru IL-6 a TNF-a pokrývající sekvence proti směru transkripčního startovacího místa a také části prvního exonu bude určena z rešerše v literatuře a za použití referenční databáze budou nejprve identifikovány CpG ostrovy. návrh primeru (http://www.cpgislands.com/). Pro analýzu methylace bude použita komerční souprava (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit od Qiagen, Hilden, Německo).

Vzorky podstoupí bisulfitovou konverzi a nemethylované cytosiny budou deaminovány za vzniku uracilu. Methylované cytosiny zůstanou nezměněny. Umístění methylovaného cytosinu v genové sekvenci a množství methylovaného cytosinu bude identifikováno a kvantifikováno pyrosekvenováním za použití zavedených technik. Výsledky budou vyjádřeny jako % methylace v promotorové oblasti IL-6 a NF-ĸB.

Poznámka: Technika pyrosekvenování může analyzovat pouze fragmenty DNA do 50 párů bází v jedné reakci. Podle údajů z CpG Island Searcher, a když bylo % GC nastaveno na 55 %, pozorováno CpG/očekávané CpG nastavené na 0,65 a mezery mezi sousedními ostrovy nastavené na 100 bp, žádné CpG ostrovy nelze nalézt ani v IL-6, ani promotor TNFa. Proto bude studován methylační stav celé promotorové oblasti v obou genech pomocí 40 párů primerů pro každý gen (aby pokryly 2 kb promotorové oblasti). Tento přístup je přijat, protože je nejcitlivější a nejspolehlivější pro stanovení místně specifické methylace DNA v rozšířené oblasti, jako je oblast promotoru.

(iii) Design studie: Toto je případová-kontrolní studie. Vzorky použité v této studii budou vzorky plné krve odebrané před a po operaci z případů a v odpovídajícím čase od kontrol.

Výpočty síly: Neexistují žádné údaje o úrovni methylace DNA v promotorové oblasti IL-6 a TNF-a u normálních zdravých subjektů. Výpočty síly ukazují, že 51 subjektů v každé skupině musí mít 80% sílu k detekci skutečného rozdílu v zájmové proměnné na 5% hladině významnosti (výpočty pomocí softwaru G*Power, verze 3.1). Do každé skupiny bude přijato celkem 60 subjektů, aby se vzala v úvahu míra opuštění.

(iv) Zpracování a analýza dat: Bude proveden párový t-test (nebo neparametrický ekvivalent) ke zkoumání rozdílů v úrovni metylace DNA před a po operaci. Ke zkoumání rozdílu v úrovni metylace DNA mezi případy a kontrolami bude použit nepárový t-test. Korelační analýza bude použita ke zkoumání vztahů mezi stavem methylace a expresí IL-6 a TNF-α. Deskriptivní statistika bude použita k popisu změn v methylačním stavu (tj. pokud jsou methylována různá místa na CpG ostrově) v promotorové oblasti IL-6 a TNF-α B, před operací a ve dvou různých časech odběru vzorků. body kontrolních subjektů.

Účel a potenciál: Toto je pilotní průzkumná environmentální epigenetická studie o vlivu bilaterální operace třetího moláru na změny metylace DNA v promotorové oblasti IL-6 a NF-ĸB a vlivu stavu metylace na genovou expresi. Výsledky poskytnou vhled a podpoří pochopení molekulárních mechanismů, jejichž prostřednictvím může stav metylace zánětlivých genů ovlivnit prožívání bolesti po operaci.