Influenze epigenetiche sul dolore acuto e cronico post-chirurgico

(i) Soggetti: Sessanta soggetti che saranno sottoposti a chirurgia del terzo molare (di seguito noti come "casi") saranno reclutati dal Queen Mary Hospital e dal Prince Philip Dental Hospital e sessanta, controlli abbinati per età e sesso che non saranno sottoposti a intervento chirurgico nei prossimi 3 mesi, che non hanno subito interventi chirurgici nell'ultimo anno (di seguito denominati 'controlli'), verranno reclutati anche dall'Ambulatorio dello stesso Ospedale.

(ii) Metodi: gli obiettivi e i dettagli dello studio saranno spiegati a ciascun soggetto e sarà richiesto il consenso informato a ciascuno di essi. Un questionario del diario del dolore sviluppato dal nostro gruppo sarà adattato per l'uso della valutazione del dolore sperimentato da ciascun soggetto prima e dopo l'intervento chirurgico. Il personale di ricerca accompagnerà ogni soggetto del caso e compilerà con loro il questionario del diario del dolore durante la visita quando verrà prelevato il sangue dei pazienti.

I seguenti questionari sanitari saranno compilati dai soggetti reclutati:

SF-36: profilo su 8 scale dei punteggi di salute funzionale e benessere, nonché misure riassuntive della salute fisica e mentale su base psicometrica HADS: valutazione dello stato psicologico dei soggetti (ansia e depressione)

Valutazione del dolore:

Il dolore a riposo e durante l'apertura sarà valutato utilizzando una scala di valutazione numerica (NRS, 1 = nessun dolore, 10 = dolore più grave) nei seguenti punti temporali:

1. Prima dell'intervento chirurgico
2. 4 ore dopo l'intervento chirurgico per 16 ore
3. Al 24, 48 e 72 dopo l'intervento
4. 1 mese dopo l'intervento tramite intervista telefonica.
5. 3 mesi dopo l'intervento tramite intervista telefonica. Se il dolore è presente, verranno poste domande sul dolore neuropatico.

Il sangue venoso EDTA (10 ml) in ogni occasione verrà prelevato da ciascun caso un'ora prima dell'intervento chirurgico, 1 ora e 3 ore dopo l'intervento. Quindi verrà chiesto loro di tornare in ospedale da 3 a 5 giorni dopo l'intervento chirurgico per un altro prelievo di sangue, e i macrofagi saranno separati dal sangue e l'RNA totale verrà estratto il prima possibile dopo il prelievo di sangue da metà delle cellule totali. Il resto delle cellule (macrofagi) sarà conservato a -80°C e preparato per l'estrazione del DNA. Il sangue venoso EDTA (20 ml) verrà prelevato da ciascun soggetto di controllo in un momento conveniente per loro e di nuovo, da 3 a 5 giorni dopo il primo prelievo di sangue. Il sangue prelevato dai soggetti di controllo sarà trattato esattamente allo stesso modo del sangue prelevato dai soggetti del caso. Pertanto, saranno ottenuti quattro campioni in totale da ciascun caso e soggetto di controllo.

La dimensione delle regioni del promotore di IL-6 e TNF-α che coprono le sequenze a monte del sito di inizio trascrizionale e parte del primo esone sarà determinata dalla ricerca in letteratura e utilizzando un database di riferimento, le isole CpG saranno identificate per la prima volta disegno del primer (http://www.cpgislands.com/). Per l'analisi della metilazione verrà utilizzato un kit commerciale (EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit di Qiagen, Hilden, Germania).

I campioni subiranno la conversione del bisolfito e le citosine non metilate saranno deaminate, formando uracili. Le citosine metilate rimarranno invariate. La posizione della citosina metilata della sequenza genica e la quantità di citosina metilata saranno identificate e quantificate mediante Pyrosequencing utilizzando tecniche consolidate. I risultati saranno espressi come % di metilazione nella regione del promotore di IL-6 e NF-ĸB.

Nota: la tecnica di pirosequenziamento può analizzare solo frammenti di DNA fino a 50 paia di basi in una reazione. Secondo i dati di CpG Island Searcher, e quando la % GC è stata impostata al 55%, CpG osservato/CpG previsto impostato a 0,65 e gli spazi tra le isole adiacenti impostati a 100 bp, non è possibile trovare alcuna isola CpG nell'IL-6 o il promotore del TNFα. Pertanto, lo stato di metilazione dell'intera regione del promotore in entrambi i geni sarà studiato utilizzando 40 coppie di primers per ciascun gene (in modo da coprire 2kb della regione del promotore). Questo approccio è adottato in quanto è il più sensibile e affidabile per la determinazione della metilazione del DNA sito specifico in una regione estesa come una regione del promotore.

(iii) Disegno dello studio: si tratta di uno studio caso-controllo. I campioni utilizzati in questo studio saranno campioni di sangue intero prelevati prima e dopo l'intervento chirurgico dai casi e, in un momento corrispondente, dai controlli.

Calcolo della potenza: non esistono dati sul livello di metilazione del DNA nella regione del promotore di IL-6 e TNF-α in soggetti sani normali. I calcoli della potenza rivelano che 51 soggetti in ciascun gruppo devono avere una potenza dell'80% per rilevare una vera differenza nella variabile di interesse a un livello di significatività del 5% (calcoli utilizzando il software G*Power, versione 3.1). Un totale di 60 soggetti sarà reclutato in ciascun gruppo per prendere in considerazione i tassi di abbandono.

(iv) Elaborazione e analisi dei dati: verrà eseguito il t-test accoppiato (o equivalente non parametrico) per studiare le differenze nel livello di metilazione del DNA prima e dopo l'intervento chirurgico. Unpaired t-test sarà utilizzato per studiare la differenza nel livello di metilazione del DNA tra casi e controlli. L'analisi correlazionale sarà utilizzata per studiare le relazioni tra lo stato di metilazione e l'espressione di IL-6 e TNF-α. Verranno impiegate statistiche descrittive per descrivere i cambiamenti nello stato di metilazione (cioè, se diversi siti nell'isola CpG sono metilati) nella regione del promotore di IL-6 e TNF-α B, pre-post intervento chirurgico e nei due diversi tempi di campionamento punti dei soggetti di controllo.

Scopo e potenziale: si tratta di uno studio esplorativo pilota di epigenetica ambientale sull'effetto della chirurgia bilaterale del terzo molare sui cambiamenti di metilazione del DNA nella regione del promotore di IL-6 e NF-ĸB e sull'influenza dello stato di metilazione sull'espressione genica. I risultati forniranno informazioni e promuoveranno la comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali lo stato di metilazione dei geni infiammatori può influenzare l'esperienza del dolore postoperatorio.