表观遗传对术后急性和慢性疼痛的影响

(i) 受试者：将从玛丽医院和菲利普牙科医院招募 60 名将接受第三磨牙手术的受试者（以下称为“病例”），以及 60 名年龄和性别匹配的不接受手术的对照组未来3个月内，过去一年内也没有接受过手术（以下简称“对照”）也将从同一医院的门诊部招募。

(ii) 方法：将向每个受试者解释研究目的和细节，并征求他们每个人的知情同意。 我们小组开发的疼痛日记问卷将适用于评估每个受试者手术前后所经历的疼痛。 研究人员会陪同每个病例对象，并在访视过程中为患者抽血，并与他们一起填写疼痛日记问卷。

以下健康问卷将由受试者招募完成：

SF-36：功能健康和幸福评分的 8 级概况以及基于心理测量的身心健康总结措施 HADS：评估受试者的心理状态（焦虑和抑郁）

疼痛评估：

将在以下时间点使用数字评定量表（NRS，1 = 无疼痛，10 = 最剧烈的疼痛）评估休息时和打开时的疼痛：

1. 手术前
2. 手术后 4 小时 16 小时
3. 手术后第 24、48 和 72 天
4. 术后1个月电话访谈。
5. 术后3个月电话访谈。 如果存在疼痛，将询问有关神经性疼痛的问题。

每次手术前一小时、手术后一小时和三小时从每个病例抽取静脉 EDTA 血 (10ml)。 然后要求他们在手术后3-5天返回医院再抽一次血，从血液中分离出巨噬细胞，并在取一半总细胞血后尽快提取总RNA。 剩余的细胞（巨噬细胞）将储存在 -80oC 并分批用于 DNA 提取。 静脉 EDTA 血液 (20ml) 将在他们方便的时间从每个对照受试者中抽取，并在第一次采血后 3 至 5 天再次抽取。 从对照受试者身上采集的血液将以与从病例受试者身上采集的血液完全相同的方式进行处理。 因此，总共将从每个病例和对照受试者中获得四个样本。

IL-6 和 TNF-α 启动子区的大小跨越转录起始位点上游的序列以及第一个外显子的一部分将通过文献检索确定，并使用数据库作为参考，首先确定 CpG 岛用于引物设计 (http://www.cpgislands.com/)。 对于甲基化分析，将使用商业试剂盒（EpiTect Plus LyseAll 亚硫酸氢盐试剂盒，来自德国希尔登的 Qiagen）。

样品将进行亚硫酸氢盐转化，未甲基化的胞嘧啶将被脱氨，形成尿嘧啶。 甲基化胞嘧啶将保持不变。 基因序列的甲基化胞嘧啶的位置和甲基化胞嘧啶的量将使用已建立的技术通过焦磷酸测序来鉴定和定量。 结果将表示为 IL-6 和 NF-ĸB 启动子区域的甲基化百分比。

注意：焦磷酸测序技术只能在一次反应中分析最多 50 个碱基对的 DNA 片段。 根据 CpG Island Searcher 的数据，当 % GC 设置为 55% 时，观察到的 CpG/预期 CpG 设置为 0.65，相邻岛之间的间隙设置为 100bp，在 IL-6 或TNFα启动子。 因此，将对每个基因使用 40 对引物（以覆盖 2kb 的启动子区域）来研究两个基因中整个启动子区域的甲基化状态。 采用这种方法是因为它对于确定扩展区域（例如启动子区域）中的位点特异性 DNA 甲基化最为灵敏和可靠。

(iii) 研究设计：这是一项病例对照研究。 本研究中使用的样本将是在手术前后从病例中以及在匹配的时间从对照中采集的全血样本。

功效计算：没有关于正常健康受试者中 IL-6 和 TNF-α 启动子区域 DNA 甲基化水平的数据。 功效计算表明，每组中的 51 名受试者需要具有 80% 的功效才能在 5% 的显着性水平下检测感兴趣变量的真实差异（使用 G*Power 软件 3.1 版进行计算）。 每组将招募总共 60 名受试者，以考虑辍学率。

(iv) 数据处理和分析：将进行配对 t 检验（或非参数等效）以研究手术前后 DNA 甲基化水平的差异。 未配对的 t 检验将用于研究病例和对照之间 DNA 甲基化水平的差异。 相关分析将用于研究甲基化状态与 IL-6 和 TNF-α 表达之间的关系。 将采用描述性统计来描述 IL-6 和 TNF-α B 启动子区域、手术前后和两个不同采样时间的甲基化状态变化（即，如果 CpG 岛中的不同位点被甲基化）控制对象的要点。

目的和潜力：这是一项探索性环境表观遗传学试点研究，旨在研究双侧第三磨牙手术对 IL-6 和 NF-ĸB 启动子区域 DNA 甲基化变化的影响，以及甲基化状态对基因表达的影响。 结果将提供洞察力并促进对炎症基因甲基化状态影响术后疼痛体验的分子机制的理解。