雑食動物、ベジタリアン、ビーガンの食事における微生物叢と関連するメタボローム (MRMOVVD)

このプロジェクトの全体的な目的は、ハイスループットで統合されたメタオミクス (ゲノム、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス) 分析を通じて、食事と唾液および糞便微生物叢との関係を見つけることです。 この文脈の中で、いくつかの問題がまだ議論されています。 たとえば、微生物の毎日の摂取量と、腸内微生物叢のバランスに対する微生物の役割は何ですか? 腸内微生物叢は主な種類の食事 (雑食、ベジタリアン、ビーガン) によってどのように影響を受けますか? 食事の種類に応じて、腸レベルで優勢な微生物グループはどれですか? 宿主の健康を維持する上での各微生物グループの推定寄与は何ですか? 食習慣に応じて、食品に含まれる主な微生物グループを定量的および定性的に決定することは、以前の質問に対応し、このプロジェクトの目的の 1 つと一致します。 特に糞便微生物叢の多様性 (ゲノミクス)、機能活性 (トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス)、代謝産物 (メタボロミクス) の推定は、このプロジェクトの全体論的アプローチと一致し、以前の質問のいくつかに答えます。 人体のさまざまなニッチにおけるさまざまな微生物集団のバランスと代謝病態の発症との間の密接な相関関係を考慮すると、このプロジェクトは、食事と代謝異常の間の可能な関係を強調する可能性のある新しい知識を提供するものとします. 食事は、病気を予防し、人間の寿命を保証する、安定した良好な口腔および腸内微生物叢を決定するための最も適切で安価なツールと見なす必要があります。 プロジェクトのこれらの全体的な目的は、次のような特定の目標に基づいて達成されるものとします。 (ii) 唾液と糞便の微生物叢とメタボロームの違いを、個人間および食事の種類間で推定する。 （iii）食事の種類に関連する微生物摂取量の質的および量的差異の推定。 (iv) 食事の種類に関連する糞便サンプルの機能的特徴の特定。これは病気の感受性の指標と見なすことができます。

このプロジェクトの全体的な目的を達成することを目的として、12 の異なる国をカバーする 16 の国内および、特に外国の機関のパートナーシップにより、10 の研究ユニット (RU; RU1-10) が提案に関与しています。 各 RU のリーダーは次のとおりです。

• RU1。 Marco Gobbetti は、提案の主任研究者であり、RU1 のリーダーです。 ISI Web of Science で報告されているように、彼は 188 の出版物の著者であり、4,075 回引用され、出版ごとの平均引用数は 21.68、h インデックスは 39 です。 彼は最近、VIA アカデミー (h-index 値が 30 を超える科学者に対する年次評価) によって Top Italian Scientists にリストされました。 RU1 は、セリアック病の腸内細菌叢の研究、および乳酸菌と食品に適用されるプロテオミクスに関する良い経験を積んできました。 RU1はプロジェクトのコーディネーターの役割を果たします。 このプロジェクト内で、RU1 は以下に関与しています。ボランティアの募集。日記の管理;生物学的サンプルの取り扱いと準備;培養に依存した方法による糞便サンプル中の主な微生物群の決定;異なる食習慣を持つ個人から選択された糞便サンプルのメタプロテオミクス特性評価;結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU1 は、同定されたタンパク質に対する機能活性および/または代謝経路の特定の帰属について、CIAL (CSIC - UAM)、マドリッド、スペイン、および科学省と協力します。アイルランドのユニバーシティ カレッジ コークの微生物学、プロテオーム研究へのバイオインフォマティクス アプローチ。
• RU2。ジャンルイジ・カルディナリはRU2のリーダーです。 ISI Web of Science で報告されているように、彼は 38 の出版物の著者であり、h インデックスは 11 です。 RU2 は、生物多様性と酵母の分類学の分野で約 20 年間活動しており、微生物学的および分子的手法によって分析されています。 このプロジェクト内で、RU2 は以下に関与しています。PCR-DGGE アプローチによる食物微生物叢の多様性の特徴付け。 PCR-DGGEアプローチによる糞便サンプルの微生物叢の特性評価;また、リーダーとして、すべての RU からの結果の統計的精緻化を管理し、共通のデータベースを提供します。 RU2 は、データのバイオインフォマティクスの精緻化のために、オランダのユトレヒトにあるCentraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) と協力します。
• RU3. Danilo Ercolini は RU3 のリーダーです。 ISI Web of Science で報告されているように、彼は 58 の出版物の著者であり、総引用数は 1,354、h インデックスは 21 です。 RU3 は、複雑な生態系、主に食物生態系の微生物生態学の研究に何年も携わってきました。 食物微生物叢は、高度な分子的アプローチと、合成培地での微生物の培養を必要としない培養に依存しない方法によって常に研究されてきました。 このプロジェクト内で、RU3 は以下に関与しています。唾液サンプル中の微生物叢の多様性の特徴付け。選択した食品サンプルのディープ シーケンス。選択された糞便および唾液サンプルのディープ シーケンス。異なる食習慣を持つ個人から選択された糞便サンプルのメタゲノミクス特性評価;結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU3 は Earth Microbiome Project (EMP、www.earthmicrobiome.org) と協力します。 これは、米国のレモントにあるアルゴンヌ国立研究所で実行され、幅広い生態系からの微生物を記述するデータ セットを作成します。
• RU4.エラスモ・ネヴィアーニはRU4のリーダーです。 ISI Web of Science で報告されているように、彼は 111 の出版物の著者であり、総引用数は 1,508、h インデックスは 22 です。 RU4 は、食品製造のさまざまな段階での微生物集団、動態、および細胞の生理学的状態の包括的かつ統合的な評価のために、食品微生物生態学において優れた経験を積んできました。 このプロジェクトの中で、RU4 は次のことに関与しています。ボランティアの募集;日記の管理;生物学的サンプルの取り扱いと準備;培養に依存した方法による糞便サンプル中の主な微生物グループの決定;日記からの結果の精緻化;文化に依存する方法および文化に依存しない方法による食品中の主要な微生物群の決定;結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU4 は、ギリシャのアテネ農業大学の食品科学技術学部と協力して、食品中、特に乳製品中の微生物を測定し、Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei の疫学ユニットと協力します。食事習慣の記録に関する支援については、イタリア、ミラノの Tumori に、食事制限に関連する推定欠乏症の監視については、イタリア、ローマの国立食品栄養研究所に協力していただきました。
• RU5.アルド・コルセッティはRU5のリーダーです。 ISI Web of Science で報告されているように、彼は 81 の出版物の著者であり、総引用数は 2,084、h インデックスは 28 です。 RU5 は、さまざまなアプリケーションのスターター カルチャーを選択するために、食品および飲料の微生物生態学の分野、ならびにバイオテクノロジーおよび機能面での菌株の特徴付けの分野で優れた経験を積んできました。 このプロジェクト内で、RU5 は次のことに関与しています。食品から分離された微生物の同定と分類;糞便サンプルの遺伝毒性の特徴付け;食品から分離された微生物の抗遺伝毒性活性の特徴付け;結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU5 は、カナダのアルバータ大学の農業、食品、栄養科学科と協力して、マルチローカス タイプ シーケンスによる食品から分離された微生物の分子タイピングを行います。
• RU6.パトリツィア・ブリジディはRU6のリーダーです。 ISI Web of Science が報告したように、彼女は 102 の出版物の著者であり、3,158 回引用され、出版物あたりの平均引用数は 32.41、h 指数は 26 です。 RU6 は、複雑な生態系 (糞便および腸生検) からの細菌の同定と分子定量化の分野、および細菌の健康上の利点に関与する分子メカニズムの分野において、統合された幅広い能力を持っています。 このプロジェクトの中で、RU6 は次のことに関与しています。ボランティアの募集。日記の管理;生物学的サンプルの取り扱いと準備;培養に依存した方法による糞便サンプル中の主な微生物グループの決定;異なる食習慣を持つ個人から選択された糞便サンプルのメタトランスクリプトミクス特性評価;結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU6 は英国レディング大学の食品微生物科学ユニットと協力してメタトランスクリプトーム プラットフォームを開発し、得られた配列を KEGG および機能活性の COG クラスターに割り当てるためのバイオインフォマティクス分析を行います。
• RU7。フランチェスカ・クレメンティはRU7のリーダーです。 ISI Web of Science によって報告されたように、彼女は 504 回引用された 59 の出版物の著者であり、出版物あたりの平均引用数は 11.25、h インデックスは 15 です。 RU7 は、食品由来の微生物、特に乳酸菌の役割、監視、制御に関する信頼できる専門知識を持っています。 このプロジェクト内で、RU7 は以下に関与しています。PCR-DGGE による食品微生物叢の多様性の特徴付け。糞便および唾液サンプルの抗生物質耐性の決定;糞便および唾液サンプルからの抗生物質耐性乳酸菌の分離および同定;微生物の抗生物質耐性に関与する遺伝子の特徴付け;細菌間で抗生物質耐性を伝達するメカニズムの研究。結果の統計的精緻化。 このプロジェクトでは、RU7 は、ギリシャのトラキアのギリシャのデモクリトス大学と、スコットランドのアバディーン大学の栄養と健康のためのローウェット研究所と協力して、食品中の伝達可能な抗生物質耐性遺伝子と分離された乳酸菌の調査を行います。唾液と糞便のサンプルから。
• RU8.ルカ・シモーネ・ココリンはRU8のリーダーです。 Scopus によって報告されたように、彼は 2,036 回引用された 131 の出版物の著者であり、h インデックスは 25 になります。 RU 8 は、微生物の生物多様性と発酵食品の活力を研究するための文化に依存しない方法の適用において豊富な経験を持っています。 また、複雑な生態系から特定の微生物を定量化するための定量的 PCR (qPCR) の知識も持っています。 このプロジェクトの中で、RU8 は次のことに関与しています。ボランティアの募集。日記の管理;生物学的サンプルの取り扱いと準備;培養に依存した方法による糞便サンプル中の主な微生物グループの決定; DNAおよびRNAレベルの両方に適用されるDGGEアプローチによる糞便微生物叢のプロファイリング。異なる食習慣を持つ個人から選択された糞便サンプルのメタゲノム特性評価;結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU8 はスロベニアのマリボル大学 (UM) と、ギリシャのアレクサンドロポリスにあるトラキアのデモクリトス大学 (DUT) と協力して、病原体と宿主細胞の相互作用を扱い、それぞれ、特定の食品に関連する特定の微生物グループの既知の有益な役割を最もよく利用する可能性がある、さまざまな食事グループの食事。
• RU9.マウロ・ロッシはRU9のリーダーです。 ISI Web of Science によって報告されたように、彼は 41 の出版物の著者であり、総引用数は 1087、h インデックスは 19 です。 RU9 は小腸の生化学と免疫学の分野で長年の経験 (>25 年) と強力な協力関係を持っています。 このプロジェクト内で、RU9 は以下に関与しています。糞便サンプルからの乳酸菌とビフィズス菌の分離。 Caco-2 細胞を用いた糞便分離株の in vitro 免疫応答の特徴付け;樹状細胞を使用した糞便分離株の in vitro 免疫応答の特徴付け。 Caco-2 および樹状細胞におけるサイトカイン分泌の測定。結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、RU9 は、スペインのバレンシアにある Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC) の Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn (モデル B の添付ファイル) と協力して、糞便微生物叢の特異性が病気の発症に役割を果たすことができるかどうかを確立します。腸の免疫機能不全。
• RU10. ルシア・ヴァンニーニはRU10のリーダーです。 ISI Web of Science で報告されているように、彼女は 27 の出版物の著者であり、総引用数は 322、h インデックスは 9 です。 RU10 は、食品微生物学の分野と、生物学的サンプルのメタボローム分析のための機器技術、特に核磁気共鳴の使用の両方で良い経験を積んできました。 このプロジェクト内で、RU10 は以下に関与しています。唾液サンプルのメタボローム特性評価;糞便および尿サンプルのメタボロームの特徴付け、および結果の統計的精緻化。 このプロジェクト内で、R10 は、いくつかの選択された食品のメタボロミクス特性評価および生物学的サンプル。 使用されるカスケード アプローチにより、プロジェクトの主な目的を達成するために、各研究活動と各 RU が不可欠になります。

この研究は、以下に説明するさまざまな活動 (AI-VI) で構成されます。

• 活動 I. 個人の募集、日誌の管理、生物学的サンプルの取り扱い、準備と保管、および糞便サンプルの微生物学的分析。
• AI.1。 個人の募集と日誌の管理（RU1、4、6、8） 約 50 人の雑食動物、ベジタリアン、ビーガンのボランティア、合計 150 人の被験者を募集します。ベジタリアンおよびビーガンの個人は、イタリア科学協会の協力を得て募集します。ベジタリアン栄養学。 雑食性の個人は、大学で公開される広告を通じて募集されます。 ほぼ同数の雑食動物、菜食主義者、菜食主義者を含む約 50 人の健康なボランティアが募集されます (年齢 18 ～ 59 歳、男女比約 . 1:1)。 募集されたボランティアは、食事習慣を記録するために、合意文書に署名するよう求められます。 日誌は、食品の特性に関する詳細な情報を得るために入念に作成され、市場に出回っている製品を簡単に識別し、摂取された推定微生物負荷を推定することができます。 大学の倫理委員会は、プロジェクトが開始される前に通知されます。
• AI.2. 生物学的サンプルの取り扱い、準備、保管 (RU1、4、6、8)。 各個人は、唾液、糞便、尿のサンプルを毎週、3 週間提供します。 個人内変動を制限するために、分析の前に 3 通のサンプルをプールします。 生体試料（唾液、糞便、尿）の種類とその後の分析（DNA、RNA、プロテオームなど）によって取り扱いが異なります。 個人の募集と生物学的サンプルの収集と同時に、ほとんどの RU が技術/方法の設定に関与します。
• AI.3. 糞便サンプルの微生物学的分析 (RU1、4、6、8)。 最初に、最も一般的な糞便微生物群を列挙するために、異なる選択培養培地に新鮮な糞便材料をプレーティングすることにより、生菌数が実行されます。
• AI.4. テクニック/メソッドの設定 (RU1、2、3、5、6、7、8、9、10)。 個人の募集と生物学的サンプルの収集と同時に、ほとんどの RU が技術/方法の設定に関与します。 メタオミクス分析のための独立した競争力のあるプラットフォームを確立するために、RU3 は、このプロジェクトの主な経済的投資であるハイスループット シーケンス用の機器を購入します。
• 活動 II. 食物微生物叢とメタボローム。 食事日記からの情報に基づいて、3 つの食事の最も代表的な食品は 3 つのカテゴリに分けられます。(i) 低 (TBC、10^3 cfu/g)。 (ii) 中間 (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); (iii) 高い (TBC ³ 10^6 cfu/g) 微生物負荷。 グループ (i) の食品については、微生物数は文献データに基づいて推定されます。 グループ (ii) および (iii) の食品については、微生物数は、市場での差別化が少ないよく知られた製品 (例えば、パルミジャーノ レッジャーノ チーズ) の場合、文献データに基づいて決定されます。市場の変動が大きい製品 (モッツァレラチーズなど)。 後者の場合、分析には市場で入手可能な多数の製品が含まれます。 食品の微生物多様性は、最初に PCR-DGGE (ポリメラーゼ連鎖反応-変性勾配ゲル電気泳動) によってより詳細に研究され、必要に応じて特定の食品の微生物叢の複雑さと現在の知識に基づいたディープ シーケンスによって研究されます。
• AII.1 食品中の微生物の定量 (RU 4、5; 7)。 食品の分析は RU4 と 5 で共有され、一部のサンプルは両方の RU で分析され、相互に結果が検証されます。 続いて、RU4 は選択された食品を LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) 分析によって特徴付け、その結果を PCR-DGGE を使用して RU7 によって得られた結果と比較します。 RU5は、食物からの分離株の大規模なコレクションを特定し、糞便水の抗遺伝毒性活性の低下と摂取された食物中の特定の微生物の存在との関係を見つけることを目指しています.
• AII.2 食品中の微生物の多様性 (RU 2、3)。 まず、このアクティビティでは、日記の記録に基づいて、ベジタリアンやビーガンが特に食べている特徴の乏しい食品を検討します。 微生物相と微生物相の両方が調査されます。 酵母および糸状菌の PCR-DGGE 分析は、rRNA のサブユニット LSU または 26S をコードする D1/D2 ドメインの一部、および ITS (内部転写スペーサー) 領域の増幅に基づきます。 細菌を検出するために、16S rRNA 遺伝子の V3 領域が標的となります。 DGGE 分析後、得られたゲルはデジタル化され、ソフトウェア Bionumerics によって分析されます。 デンドログラムはクラスター分析にかけられ、85％の類似係数を持つサンプルをさらなる配列決定から除外します。このような選択により、次世代シーケンシングのコストが節約され、バイオインフォマティクスを介して分析される管理可能な量のデータを取得できるようになります。 RU3 は、分類学的に関心のある可変遺伝子のアンプリコンのライブラリを使用し、購入するシーケンシング プラットフォームのタイプに応じた特定の手順を使用して、ディープ シーケンシングを実行します。 シーケンス結果は、RU2 によってバイオインフォマティクスに基づいて詳しく説明されます。
• AII.3 食品メタボローム (RU 10)。 食生活に関する情報に基づいて、3 つの食事に最も多く含まれる発酵食品を分析して、摂取された化合物 (サリチル酸など) と生物学的サンプルで推定的に回収された化合物との間の可能な関係を見つけます。 メタボローム分析は、GC-MS/SPME (ガスクロマトグラフィー-質量分析/固相マイクロ抽出) および FTIR (フーリエ変換赤外線) 分光法によって実行されます。
• 活動 III. 糞便と唾液の微生物叢。 予備的に、すべての ca からのすべての唾液と糞便のサンプル。 微生物の多様性の概要を把握するために、150 人のボランティアが PCR-DGGE 分析を受けます。 RT-PCR-DGGE (リアルタイム - ポリメラーゼ連鎖反応 - 変性勾配ゲル電気泳動) も、糞便中の生存集団を推定するために考慮されます。 これらの分析に基づいて、各食習慣の代表的なサンプルが次世代シーケンシングにかけられます。 これらすべての結果の出力により、メタオミクス分析の対象となる 3 つの食事のそれぞれについて、4/5 の糞便サンプルを段階的に選択できるはずです。
• 活動 III.1. 生物多様性の研究。
• AIII.1.1. PCR-DGGE プロファイリング (RU 2、3、8) 酵母および糸状菌の PCR-DGGE 分析は、26S rRNA および ITS 領域をターゲットにし、16S rRNA の V3 および/または V6-V8 領域を細菌について研究します。 DNA と RNA の両方 (RT-PCR 後) をターゲットとして使用して、それぞれ総集団と実行可能な集団を調査します。 同じ実験条件下で、RU3 は唾液サンプルの細菌の多様性を特徴付けます。 DGGE、DNA および RNA サンプルからの画像およびクラスター分析の後、グローバル集団と実行可能な集団の違いを定義することが可能になります。 類似性のデンドログラムは、85%以上の類似性係数を有するサンプルをさらなる配列決定活動から除外するために使用されます。このような選択は、次世代シーケンシング分析のコストを節約し、バイオインフォマティクスを介して分析される管理可能な量のデータを取得することを保証します。
• AIII.1.2. 次世代シーケンシング (RU 3、8) 選択された唾液および糞便サンプルのディープ シーケンシングは、分類学的に関心のある可変遺伝子のアンプリコンのライブラリを使用して行われます。 細菌と真菌の両方について得られたすべてのシーケンス結果は、RU2 によってバイオインフォマティクスに基づいて精緻化されます。
• AIII.1.3. 抗生物質耐性 (RU 7) 唾液および糞便サンプルから直接抽出された DNA は、PCR アッセイを使用して、いくつかの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子の発生についてスクリーニングされます。 抗生物質耐性（AR）遺伝子が陽性であることが判明したサンプルは、抗生物質耐性の乳酸菌、乳酸球菌、および腸球菌を分離するために使用されます。 識別後、対応するブレークポイントよりも高い最小発育阻止濃度 (MIC) の値を示す分離株は、対応する AR 遺伝子の PCR 増幅によって確認されます。 遺伝的可動要素に局在するAR遺伝子を分離株から臨床的に関心のある細菌に移す可能性は、接合試験によって評価されます。
• AIII.2. 選択された糞便サンプルのメタオミクス分析 カスケード アプローチによると、糞便サンプルの微生物多様性の研究からの結果は、3 種類の食事のそれぞれを代表する 4/5 個体を選択します (4/5 x 3 = 12/ 15) メタオミクス解析を受ける。 メタオミクスのアプローチは、合成されたタンパク質の完全なビューを可能にする 12/15 人の糞便マイクロバイオームからの DNA および RNA シーケンスで構成される社内データベースを提供します。
• AIII.2.1. メタゲノミクス (RU3、8) 糞便 DNA が定量化され、ショットガン シーケンス プロトコルがメタゲノミクス解析に適用されます。 このタスクは、糞便および唾液の DNA および cDNA アンプリコンの分析にフルタイムで従事するシーケンス プラットフォームのパフォーマンスと可用性に応じて、RU3 によって実行される必要があります。 または、専門の会社がこのタスクをサービスとして実行します。
• AIII.2.2. メタトランスクリプトミクス (RU 6) 全体的な微生物遺伝子発現プロファイルは、プロジェクトの最初の数ヶ月間に設定された革新的なイルミナベースのメタトランスクリプトミクスアプローチとプロトコルを使用して特徴付けられます。 cDNAは、最適化された手順に従ってRNAから合成されます。 cDNAのランダム増幅が実行され、イルミナHiSeqプラットフォームを使用してcDNAが配列決定されます。 配列決定されたメタトランスクリプトームは、Velvet/MetaVelvet または SOAPdenovo パッケージを使用して組み立てられ、可能な限り最大のコンセンサス配列を実現します。 転写産物の配列には、確立されたパイプラインを使用して注釈が付けられ、転写産物は、RPS-BLAST (Reversed Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) を使用して、KEGG (遺伝子とゲノムの京都百科事典)、COG (オルソロガス グループのクラスター) に対して検索されます。 Genbank データベース。 nr BLASTX によって識別される細菌様読み取りは、COG データベースに対してさらに検索されます。 シーケンスの機能的役割は、KEGG および COG 検索に基づいて割り当てられます。
• AIII.2.3. メタプロテオミクス (RU1) アクティビティの最初の数か月以内に設計されたワークフローに基づいて、各糞便サンプルからタンパク質が抽出され、ゲルフリーおよび/またはゲルベースのプロテオミクスによって分析されます。 ペプチドの同定は、質量分析計 Finnigan LCQ Deca XP MAX を使用して実行されます。 示差プロテオーム解析が行われます。 ペプチド同定では、Open Mass Spectra Search Algorithm を使用して、利用可能なデータベースに対して MS/MS スペクトルを検索します。 さらに機能的な情報を取得するために、COG 分類に基づくタンパク質に注釈が付けられます。 特定された COG は、KEGG 代謝経路データベースにマッピングされ、iPath のオンライン アプリケーションによって視覚化されます。 FDR 補正後、同定されたすべてのペプチドは UniProtKB に対して検索され、マッピングされます。 識別されたすべてのタンパク質の最高の機能レベルに対処するために、識別された COG が KEGG 経路にマッピングされます。 共通の微生物コアに加えて、個体間および食事間の違いは、代謝機能の観点から決定されます。
• アクティビティ IV. 機能特性評価。 糞便サンプルおよび糞便サンプルからの微生物分離株のいくつかの機能的特徴の特徴付けは、食事と腸内微生物叢の間のリンクを強化します。
• AIV.1 糞便の遺伝毒性および抗遺伝毒性活性 (RU 5) 糞便水 (FW) のサンプルを調製し、コメットアッセイによって遺伝毒性を測定します。 FW に同時暴露され、LMA スライドに組み込まれた HT29 腸細胞 (10^6 細胞/アッセイ) は、単一細胞ゲル電気泳動 (SCGE) にかけられ、落射蛍光によって分析されます。 腸内に潜在的に存在する遺伝毒性化合物および変異原性化合物に対する阻害活性について、食品からのいくつかの微生物分離株を調査します。 微生物-遺伝子毒素共培養の効果は、SOS-Chromotest (標的大腸菌 PQ37 sfiA:lacZ) を使用した化合物の残留遺伝毒性活性の評価と、並行してコメットアッセイ (標的腸細胞 HT29 ）。
• AIV.2。 糞便微生物と免疫応答の調節 (RU 9) 樹状細胞 (DC) と Caco-2 細胞の成長と分化の条件は、活動の最初の数ヶ月以内に設定されます。 乳酸桿菌とビフィズス菌はすべての糞便サンプルから分離され、腸細胞における免疫メディエーターの発現を検出するための照射細菌として使用されます。 IL-8および寛容原性TGF-ベータ(形質転換増殖因子ベータ)およびTSLP(胸腺間質リンホポエチン)の転写物および同族タンパク質分泌レベルが決定される。 照射された細菌は、DC 細胞の表面マーカーを刺激するためにも使用されます。 Caco-2 および DC 細胞から全 RNA を抽出し、IL-8、TGF-ベータ、TSLP、TNF-アルファ、IL-12p40、および IL-10 の相対的な遺伝子発現を調べるために cDNA を調製します。対応する遺伝子産物の濃度は、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって決定されます。
• ATTIVITY V. 唾液、糞便および尿のメタボローム (RU10)。 「オミクス」アプローチを完成させるために、糞便、尿、唾液のサンプルのメタボロームを 3 つの技術 (GC-MS/SPME、FTIR/ATR (フーリエ変換赤外線/減衰全反射)、NMR (核磁気共鳴)) で分析します。以前に設定されたプロトコルに従って。 化合物は、質量スペクトル データベース、文献の質量スペクトル データ、および/または純粋な化合物からのデータを使用して識別されます。 尿と唾液のサンプルを解凍すると、NMR 分析は 2 時間以内に実行されます。 糞便サンプルは、水溶性分子の完全な回収に最大の重要性を与えて準備されます。 NMR スペクトルは、iCoshift アルゴリズムを介して小さなピークのずれを修正することにより、統計分析用に準備されます。
• 態度 VI. 結果の統計的精緻化 (すべての RU)。 プロジェクトの開発中、RU2 はパートナーの CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures、ユトレヒト、NL) と協力して Web サイトのメンテナンスを行い、サイトはさまざまな研究活動からすべての結果を収集します。 このデータベースは、「R モード」での分析に使用され、3 つの食事の多様性を決定する際のさまざまな記述子の影響を評価し、「Q モード」で 3 つの食事の違いを決定します。 同時に、最も関連性の高い結果は、科学出版物を通じて査読付きジャーナルに広められます。

研究対象のトピックを考慮すると、このプロジェクトは間違いなく潜在的な側面を適用しています。 たとえば、人間の微生物叢に対する食事の影響に関する知識は、統合ケア推進のキャンペーンで配布される適切なガイドラインの準備につながる可能性があります。 消費者の好み、態度、ニーズ、行動、ライフスタイル、および教育が考慮され、インフォームド チョイスと生活の質への影響を改善するために、消費者とフード チェーン研究コミュニティとの間のコミュニケーションが強化されます。 個人が正しい食生活を通じて健康を改善および管理できるようにすることは、医療システムのコスト削減につながります。