Microbiota y metaboloma relacionado en dietas omnívoras, vegetarianas o veganas (MRMOVVD)

El objetivo general de este proyecto es encontrar la relación entre la dieta y la saliva y la microbiota fecal, a través de análisis metaómicos integrados (genómicos, transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos) de alto rendimiento. Varias cuestiones aún se debaten en este contexto. Por ejemplo, ¿cuál es la ingesta diaria de microbios y su papel en el equilibrio de la microbiota intestinal? ¿Cómo se ve afectada la microbiota intestinal por los principales tipos de dieta (omnívora, vegetariana y vegana)? ¿Cuáles son los grupos microbianos predominantes a nivel intestinal, según el tipo de dieta? ¿Cuál es la presunta contribución de cada grupo microbiano en el mantenimiento de la salud del huésped? La determinación cuantitativa y cualitativa de los principales grupos microbianos albergados en los alimentos, en función de los hábitos alimentarios, responde a una pregunta anterior y coincide con uno de los objetivos de este proyecto. La estimación de la diversidad (genómica), actividad funcional (transcriptómica y proteómica) y metabolitos (metabolómica) de, en especial, la microbiota fecal coincide con el enfoque holístico de este proyecto y responde a varias de las preguntas anteriores. Teniendo en cuenta la estrecha correlación entre el equilibrio de diferentes poblaciones microbianas en varios nichos del cuerpo humano y la aparición de patologías metabólicas, este proyecto proporcionará conocimientos novedosos que pueden resaltar las posibles relaciones entre la dieta y los desmetabolismos. La dieta debe ser considerada como la herramienta más adecuada y económica para determinar una microbiota oral e intestinal estable y favorable, que prevenga enfermedades y garantice la longevidad humana. Estos objetivos generales del proyecto se alcanzarán sobre la base de metas específicas, tales como: (i) la identificación de marcadores biológicos, moleculares y metabólicos específicos del tipo de dieta; (ii) la estimación de las diferencias en la microbiota y el metaboloma de la saliva y las heces, tanto entre individuos como entre tipos de dieta; (iii) la estimación de las diferencias cualitativas y cuantitativas en la ingesta microbiana relacionada con el tipo de dieta; y (iv) la identificación de las características funcionales de las muestras fecales relacionadas con el tipo de dieta, que pueden ser consideradas como indicadores de susceptibilidad a enfermedades.

Con el fin de alcanzar el objetivo general de este proyecto, diez Unidades de Investigación (RUs; RU1-10) están involucradas en la propuesta, con la asociación de 16 Instituciones Nacionales y, especialmente, extranjeras, que cubren 12 países diferentes. Los líderes de cada RU se reportan a continuación:

• RU1. Marco Gobbetti es el Investigador Principal de la propuesta y líder de RU1. Según informa ISI Web of Science, es autor de 188 publicaciones que fueron citadas 4.075 veces, con una media de citas por publicación de 21,68 y un índice h de 39. Recientemente ha sido incluido en la lista de los mejores científicos italianos por la Academia VIA (evaluación anual para científicos que tienen un valor de índice h superior a 30). El RU1 ha adquirido una buena experiencia en el estudio de la microbiota intestinal de los celíacos, y en la proteómica aplicada a bacterias ácido lácticas y alimentos. RU1 desempeñará el papel de coordinador del proyecto. Dentro de este proyecto, RU1 participa en: captación de voluntarios; administración de diarios; manipulación y preparación de muestras biológicas; determinación de los principales grupos microbianos en las muestras fecales por métodos dependientes del cultivo; caracterización meta-proteómica de muestras fecales seleccionadas de individuos con diferentes hábitos alimentarios; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, el RU1 colaborará con el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, España, para la atribución específica de actividades funcionales y/o vías metabólicas a las proteínas identificadas y con el Departamento de Microbiología del University College Cork, Irlanda, por el enfoque bioinformático de los estudios del proteoma.
• RU2. Gianluigi Cardinali es el líder de RU2. Según informa ISI Web of Science, es autor de 38 publicaciones con un índice h de 11. La RU2 opera desde hace aproximadamente veinte años en el campo de la biodiversidad y taxonomía de las levaduras, las cuales son analizadas a través de técnicas microbiológicas y moleculares. Dentro de este proyecto, RU2 está involucrado en: caracterización de la diversidad de la micobiota alimentaria a través del enfoque PCR-DGGE; caracterización de la micobiota de muestras fecales mediante abordaje PCR-DGGE; y, como líder, en la gestión de la elaboración estadística de los resultados de todas las EE. FF., proporcionando una base de datos común. El RU2 colaborará con el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Países Bajos, para la elaboración bioinformática de los datos.
• RU3. Danilo Ercolini es el líder de RU3. Según informa ISI Web of Science, es autor de 58 publicaciones, con un número total de citas de 1.354 y un índice h de 21. El RU3 ha estado involucrado durante años en estudios de ecología microbiana de ecosistemas complejos, principalmente ecosistemas alimentarios. La microbiota alimentaria siempre se ha estudiado mediante enfoques moleculares avanzados y métodos independientes del cultivo que no requieren el cultivo de microorganismos en medios sintéticos. Dentro de este proyecto, RU3 participa en: caracterización de la diversidad de la microbiota en muestras de saliva; secuenciación profunda de muestras de alimentos seleccionadas; secuenciación profunda de muestras de saliva y heces seleccionadas; caracterización meta-genómica de muestras fecales seleccionadas de individuos con diferentes hábitos alimentarios; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, la RU3 colaborará con Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) que se ejecuta en el Laboratorio Nacional de Argonne, Lemont, Estados Unidos, para crear conjuntos de datos que describen microorganismos de una amplia gama de ecosistemas.
• RU4. Erasmo Neviani es el líder de RU4. Según informa ISI Web of Science, es autor de 111 publicaciones, con un número total de citas de 1.508 y un índice h de 22. El RU4 ha ganado una buena experiencia en ecología microbiana de alimentos para una evaluación completa e integrada de las poblaciones microbianas, la dinámica y el estado fisiológico de las células en varias etapas de la fabricación de alimentos. Dentro de este proyecto, RU4 se involucra en: elaboración de diarios; reclutamiento de voluntarios; administración de diarios; manipulación y preparación de muestras biológicas; determinación de los principales grupos microbianos en las muestras fecales mediante métodos dependientes del cultivo; elaboración de los resultados de los diarios; determinación de los principales grupos microbianos en los alimentos mediante métodos independientes y dependientes del cultivo; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, el RU4 colaborará con el Departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos de la Universidad Agrícola de Atenas, Grecia, para la determinación microbiana en alimentos y, especialmente, en productos lácteos, con la Unidad de Epidemiología de la Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori de Milán, Italia, por la asistencia en el registro de hábitos dietéticos, y con el Instituto Nacional de Investigación en Alimentos y Nutrición de Roma, Italia, por monitorear las supuestas deficiencias relacionadas con los regímenes dietéticos restrictivos.
• RU5. Aldo Corsetti es el líder de RU5. Según informa ISI Web of Science, es autor de 81 publicaciones con un número total de citas de 2.084 y un índice h de 28. RU5 ha adquirido una buena experiencia en el campo de la ecología microbiana de alimentos y bebidas, así como en el de la caracterización de cepas para aspectos biotecnológicos y funcionales, con el fin de seleccionar cultivos iniciadores para diferentes aplicaciones. Dentro de este proyecto, RU5 está implicado en: determinación de los principales grupos microbianos en alimentos mediante métodos dependientes del cultivo; identificación y tipificación de microbios aislados de alimentos; caracterización de la genotoxicidad de muestras fecales; caracterización de la actividad anti-genotoxigénica de aislados microbianos de alimentos; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, el RU5 colaborará con el Departamento de Ciencias Agrícolas, Alimentarias y Nutricionales de la Universidad de Alberta, Canadá, para la tipificación molecular de microorganismos aislados en alimentos mediante una secuenciación de tipo multilocus.
• RU6. Patrizia Brigidi es la líder de RU6. Según informa ISI Web of Science, es autora de 102 publicaciones que fueron citadas 3.158 veces, con una media de citas por publicación de 32,41 y un índice h de 26. RU6 tiene una consolidada y amplia competencia en el campo de la identificación y cuantificación molecular de bacterias de ecosistemas complejos (heces y biopsias intestinales) y en el campo de los mecanismos moleculares responsables de los beneficios para la salud de las bacterias. Dentro de este proyecto, RU6 participa en: captación de voluntarios; administración de diarios; manipulación y preparación de muestras biológicas; determinación de los principales grupos microbianos en las muestras fecales mediante métodos dependientes del cultivo; caracterización metatranscriptómica de muestras fecales seleccionadas de individuos con diferentes hábitos alimentarios; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, el RU6 colaborará con la Food Microbial Science Unit, University of Reading, Reino Unido, en el desarrollo de la plataforma metatranscriptómica y en el análisis bioinformático de las secuencias obtenidas para su asignación al cluster de actividades funcionales KEGG y COG.
• RU7. Francesca Clementi es la líder de RU7. Según informa ISI Web of Science, es autora de 59 publicaciones que fueron citadas 504 veces, con una media de citas por publicación de 11,25 y un índice h de 15. El RU7 tiene una experiencia confiable sobre el papel, el seguimiento y el control de los microorganismos transmitidos por los alimentos, especialmente las bacterias del ácido láctico. Dentro de este proyecto, RU7 está involucrado en: caracterización de la diversidad de la microbiota alimentaria por PCR-DGGE; determinación de la resistencia a antibióticos en muestras de heces y saliva; aislamiento e identificación de bacterias del ácido láctico resistentes a los antibióticos a partir de muestras de saliva y heces; caracterización de los genes implicados en la resistencia microbiana a los antibióticos; estudio de los mecanismos de transferencia de resistencia antibiótica entre bacterias; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, el RU7 colaborará con la Universidad griega Demócrito de Tracia, Grecia, y con el Instituto Rowett de Nutrición y Salud de la Universidad de Aberdeen, Escocia, en la investigación de genes transferibles de resistencia a antibióticos en alimentos y bacterias ácido lácticas aisladas. de muestras de saliva y heces.
• RU8. Luca Simone Cocolin es el líder de RU8. Según lo informado por Scopus, es autor de 131 publicaciones que fueron citadas 2.036 veces, lo que da como resultado un índice h de 25. El RU 8 tiene una amplia experiencia en la aplicación de métodos independientes del cultivo para el estudio de la biodiversidad microbiana y la vitalidad en alimentos fermentados. También tiene conocimientos de PCR cuantitativa (qPCR) para la cuantificación de microorganismos específicos de ecosistemas complejos. Dentro de este proyecto, RU8 participa en: captación de voluntarios; administración de diarios; manipulación y preparación de muestras biológicas; determinación de los principales grupos microbianos en las muestras fecales mediante métodos dependientes del cultivo; perfiles de la microbiota fecal mediante enfoques de la DGGE aplicados tanto a nivel de ADN como de ARN; caracterización metagenómica de muestras fecales seleccionadas de individuos con diferentes hábitos alimentarios; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, RU8 colaborará con la Universidad de Maribor (UM), Eslovenia, y la Universidad Demócrito de Tracia (DUT), Alexandroupolis, Grecia, en aspectos relacionados con la interacción de patógenos-células huésped y para posibles modificaciones del dieta de los diferentes grupos de dieta, que mejor pueden aprovechar el papel beneficioso conocido de ciertos grupos microbianos asociados con alimentos específicos, respectivamente.
• RU9. Mauro Rossi es el líder de RU9. Según informa ISI Web of Science, es autor de 41 publicaciones, con un número total de citas de 1087 y un índice h de 19. El RU9 tiene una larga experiencia (>25 años) y fuertes colaboraciones en el campo de la bioquímica e inmunología del intestino delgado. Dentro de este proyecto, RU9 está involucrado en: aislamiento de lactobacilos y bifidobacterias a partir de muestras fecales; caracterización de la respuesta inmune in vitro de aislados fecales utilizando células Caco-2; caracterización de la respuesta inmune in vitro de aislados fecales utilizando células dendríticas; medición de la secreción de citoquinas en Caco-2 y células dendríticas; y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, RU9 colaborará con Ecofisiología Microbiana y Nutrición, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, España (anexo en el Modelo B), para establecer si las peculiaridades de la microbiota fecal podrían desempeñar un papel en la aparición de disfunciones inmunes intestinales.
• RU10. Lucia Vannini es la líder de RU10. Según informa ISI Web of Science, es autora de 27 publicaciones con un número total de citas de 322 y un índice h de 9. El RU10 ha adquirido una buena experiencia tanto en el área de la microbiología alimentaria como en el uso de técnicas instrumentales, y en particular la resonancia magnética nuclear, para el análisis del metaboloma de muestras biológicas. Dentro de este proyecto, RU10 está involucrado en: caracterización del metaboloma de alimentos seleccionados; caracterización del metaboloma de muestras de saliva; caracterización del metaboloma de muestras de heces y orina, y elaboración estadística de los resultados. Dentro de este proyecto, R10 colaborará con el Instituto Sueco de Alimentos y Biotecnología, Suecia, y el Instituto de Tecnología Química, Departamento de Investigación y Desarrollo, Praga, República Checa, en aspectos, respectivamente, relacionados con la caracterización metabolómica de algunos alimentos seleccionados y muestras biológicas. El enfoque en cascada utilizado hará que cada actividad de investigación y cada RU sean indispensables para lograr los objetivos principales del proyecto.

Este estudio estará compuesto por diferentes actividades (AI-VI) que se describen a continuación:

• ACTIVIDAD I. Reclutamiento de individuos, administración de diarios, manejo, preparación y almacenamiento de muestras biológicas y análisis microbiológicos de muestras fecales.
• AI.1. Reclutamiento de individuos y administración de diarios (RU1, 4, 6, 8) Se reclutarán alrededor de 50 voluntarios omnívoros, vegetarianos y veganos, para un total de 150 sujetos. Se reclutarán individuos vegetarianos y veganos con la cooperación de la Sociedad Científica Italiana de Nutrición Vegetariana. Los individuos omnívoros serán reclutados a través de anuncios publicados en las Universidades. Se reclutarán alrededor de 50 voluntarios sanos, incluido un número aproximadamente igual de omnívoros, vegetarianos y veganos (de 18 a 59 años de edad, proporción hombre/mujer aprox. 1:1). A los voluntarios reclutados se les pedirá que firmen un documento de consenso, para registrar sus hábitos alimenticios. Los diarios serán elaborados para obtener información detallada sobre las características de los alimentos, permitiendo una fácil identificación de los productos en el mercado y una estimación de la presunta carga microbiana ingerida. Se informará al Comité de Ética de las Universidades antes del inicio del proyecto.
• AI.2. Manipulación, preparación y almacenamiento de muestras biológicas (RU1, 4, 6, 8). Cada individuo suministrará muestras de saliva, heces y orina semanalmente, por un lapso de tres semanas. Las muestras por triplicado se agruparán antes de los análisis para limitar la variabilidad intraindividual. La manipulación se realizará de forma diferente según el tipo de muestras biológicas (saliva, heces, orina) y los análisis posteriores (p. ej., ADN, ARN, proteoma). Simultáneamente al reclutamiento de individuos y la recolección de muestras biológicas, la mayoría de las EF estarán involucradas en la puesta en marcha de las técnicas/métodos.
• AI.3. Análisis microbiológicos de muestras fecales (RU1, 4, 6, 8). En un primer momento, los recuentos viables se realizarán sembrando material fecal fresco en diferentes medios de cultivo selectivos, para enumerar los grupos microbianos fecales más comunes.
• AI.4. Puesta a punto de técnicas/métodos (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Simultáneamente al reclutamiento de individuos y la recolección de muestras biológicas, la mayoría de las EF estarán involucradas en la puesta en marcha de las técnicas/métodos. Con el fin de establecer una plataforma independiente y competitiva para análisis metaómicos, RU3 comprará equipos para secuenciación de alto rendimiento, que es una inversión económica principal en este proyecto.
• ACTIVIDAD II. Microbiota alimentaria y metaboloma. Con base en la información de los diarios dietéticos, los alimentos más representativos de las 3 dietas se dividirán en 3 categorías: (i) bajo (TBC, 10^3 ufc/g); (ii) intermedio (TBC 10^3 - 10^6 ufc/g); y (iii) alta carga microbiana (TBC ³ 10^6 ufc/g). Para los alimentos del grupo (i), el número microbiano se estimará en función de los datos de la literatura. Para los alimentos de los grupos (ii) y (iii), el número microbiano se determinará con base en datos de la literatura en el caso de productos bien conocidos con poca diferenciación en el mercado (p. ej., queso Parmigiano Reggiano), mientras que se realizarán análisis apropiados en el caso de productos con gran variabilidad de mercado (por ejemplo, queso mozzarella). En este último caso, los análisis involucrarán una gran cantidad de productos disponibles en el mercado. La diversidad microbiana de los alimentos se estudiará más a fondo primero mediante PCR-DGGE (reacción en cadena de la polimerasa-electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) y, cuando sea necesario, mediante secuenciación profunda sobre la base del nivel de complejidad y el conocimiento actual de la microbiota de los alimentos específicos.
• AII.1 Determinación cuantitativa de microorganismos en alimentos (RU 4, 5; 7). El análisis de los alimentos se compartirá entre la RU 4 y la 5, y ambas RU analizarán algunas muestras para validar recíprocamente los resultados. Posteriormente, RU4 caracterizará los alimentos seleccionados mediante análisis LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction), y los resultados se compararán con los obtenidos por RU7 mediante PCR-DGGE. RU5 identificará una gran colección de aislados de alimentos, con el objetivo de encontrar posibles relaciones con una actividad antigenotóxica reducida de las aguas fecales y la presencia de microorganismos específicos en los alimentos ingeridos.
• AII.2 Diversidad microbiana en los alimentos (RU 2, 3). En primer lugar, esta actividad considerará los alimentos poco caracterizados que comen específicamente los vegetarianos y los veganos según los registros de los diarios. Se investigarán tanto la microbiota como la micobiota. Los análisis PCR-DGGE para levaduras y hongos filamentosos se basarán en la amplificación de partes del dominio D1/D2 que codifica la subunidad LSU o 26S del ARNr y las regiones ITS (espaciador transcrito interno). La región V3 del gen 16S rRNA será el objetivo de la detección de bacterias. Después del análisis DGGE, los geles resultantes serán digitalizados y analizados por el software Bionumerics. Los dendogramas se someterán a análisis de conglomerados para excluir de la secuenciación posterior aquellas muestras que tengan un coeficiente de similitud del 85 %; dicha selección ahorrará costos de secuenciación de próxima generación y asegurará obtener una cantidad manejable de datos para ser analizados a través de la bioinformática. RU3 realizará la secuenciación profunda utilizando bibliotecas de amplicones de genes variables de interés taxonómico y utilizando procedimientos específicos según el tipo de plataforma de secuenciación que se vaya a adquirir. Los resultados de la secuenciación serán elaborados de forma bioinformática por el RU2.
• AII.3 Metaboloma de los alimentos (RU 10). A partir de la información sobre hábitos alimentarios, se analizarán los alimentos fermentados más representados en las tres dietas, para encontrar una posible relación entre los compuestos químicos ingeridos (p. ej., ácido salicílico) y los presuntamente recuperados en muestras biológicas. Los análisis del metaboloma se realizarán mediante GC-MS/SPME (cromatografía de gases-espectrometría de masas/microextracción en fase sólida) y espectroscopia FTIR (infrarrojo por transformada de Fourier).
• ACTIVIDAD III. La microbiota de las heces y la saliva. Preliminarmente, todas las muestras de saliva y heces de todos los ca. 150 voluntarios serán sometidos a análisis PCR-DGGE para obtener una visión general de la diversidad microbiana. También se considerará la RT-PCR-DGGE (Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real- Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) para estimar las poblaciones viables en las heces. Sobre la base de estos análisis, muestras representativas de cada hábito dietético se someterán a la secuenciación de próxima generación. La salida de todos estos resultados debería permitir, paso a paso, la selección de 4/5 muestras fecales para cada una de las tres dietas para someterlas a análisis metaómicos.
• ACTIVIDAD III.1. Estudio de la biodiversidad.
• AIII.1.1. Perfiles de PCR-DGGE (RU 2, 3, 8) Los análisis de PCR-DGGE para levaduras y hongos filamentosos se centrarán en las regiones 26S rRNA e ITS, mientras que las regiones V3 y/o V6-V8 del 16S rRNA se estudiarán en busca de bacterias. Tanto el ADN como el ARN (después de la RT-PCR) se utilizarán como objetivo para investigar poblaciones totales y viables, respectivamente. Bajo las mismas condiciones experimentales, RU3 caracterizará la diversidad bacteriana de las muestras de saliva. Después de los análisis DGGE, de imágenes y de conglomerados de muestras de ADN y ARN, será posible definir una diferencia entre la población global y la población viable. Los dendrogramas de similitud se utilizarán para excluir de la actividad de secuenciación posterior aquellas muestras que tengan un coeficiente de similitud ³ 85%; dicha selección ahorrará costos de los análisis de secuenciación de próxima generación y asegurará obtener una cantidad manejable de datos para ser analizados a través de la bioinformática.
• AIII.1.2. Secuenciación de próxima generación (RU 3, 8) La secuenciación profunda en muestras fecales y de saliva seleccionadas se realizará utilizando bibliotecas de amplicones de genes variables de interés taxonómico. Todos los resultados de secuenciación obtenidos tanto para bacterias como para hongos serán elaborados de forma bioinformática por el RU2.
• AIII.1.3. Resistencia a los antibióticos (RU 7) El ADN extraído directamente de muestras de saliva y heces se analizará para detectar la aparición de genes que codifican resistencias a varios antibióticos mediante ensayos de PCR. Las muestras que resulten positivas para los genes de resistencia a los antibióticos (AR) se utilizarán para aislar lactobacilos, lactococos y enterococos resistentes a los antibióticos. Después de la identificación, los aislamientos que muestren valores de concentración inhibitoria mínima (MIC) superiores a los puntos de corte correspondientes se confirmarán mediante la amplificación por PCR de los genes AR correspondientes. La posibilidad de transferir genes AR localizados en elementos genéticos móviles de aislados a bacterias de interés clínico se evaluará mediante ensayos de conjugación.
• AIII.2. Análisis metaómicos de muestras fecales seleccionadas De acuerdo con el enfoque en cascada, los resultados del estudio de la diversidad microbiana de las muestras fecales seleccionarán 4/5 individuos representativos de cada uno de los 3 tipos de dieta (4/5 x 3 = 12/ 15) para ser sometido a análisis metaómicos. Los enfoques meta-ómicos proporcionarán una base de datos interna, que consistirá en las secuencias de ADN y ARN de los microbiomas fecales de los 12/15 individuos, lo que permitirá una visión completa de las proteínas sintetizadas.
• AIII.2.1. Metagenómica (RU3, 8) Se cuantificará el ADN fecal y se aplicará un protocolo de secuenciación de escopeta para el análisis metagenómico. Esta tarea deberá ser realizada por el RU3, dependiendo del rendimiento y disponibilidad de la plataforma de secuenciación, que se dedicará a tiempo completo al análisis de ADN y amplicones de ADNc de heces y saliva. Alternativamente, empresas especializadas realizarán esta tarea como un servicio.
• AIII.2.2. Metatranscriptómica (RU 6) El perfil general de expresión génica microbiana se caracterizará mediante un enfoque metatranscriptómico innovador basado en Illumina y el protocolo establecido durante los primeros meses del proyecto. El ADNc se sintetizará a partir del ARN según procedimientos optimizados. Se realizará una amplificación aleatoria del ADNc y se secuenciará el ADNc mediante la plataforma Illumina HiSeq. Los metatranscriptomas secuenciados se ensamblarán utilizando paquetes Velvet/MetaVelvet o SOAPdenovo para lograr la mayor secuencia de consenso posible. Las secuencias de las transcripciones se anotarán mediante canalizaciones bien establecidas y las transcripciones se buscarán mediante RPS-BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica específica de posición inversa) contra KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto), COG (Clusters of Orthologous Groups) y las bases de datos Genbank. Las lecturas similares a bacterias identificadas por nr BLASTX se buscarán más en la base de datos COG. Los roles funcionales de las secuencias se asignarán en función de las búsquedas KEGG y COG.
• AIII.2.3. Metaproteómica (RU1) Con base en el flujo de trabajo diseñado dentro de los primeros meses de actividad, las proteínas se extraerán de cada muestra fecal y se analizarán mediante proteómica sin gel y/o basada en gel. La identificación de péptidos se realizará mediante el espectrómetro de masas Finnigan LCQ Deca XP MAX. Se realizará un análisis proteómico diferencial. Para la identificación de péptidos, se utilizará el algoritmo abierto de búsqueda de espectros de masas para buscar espectros de MS/MS en las bases de datos disponibles. Para recuperar más información funcional, se anotarán las proteínas basadas en la clasificación COG. Los COG identificados se mapearán en la base de datos de rutas metabólicas de KEGG y se visualizarán mediante la aplicación en línea de iPath. Después de la corrección FDR, todos los péptidos identificados se buscarán frente a UniProtKB y luego se mapearán. Para abordar el nivel funcional más alto de todas las proteínas identificadas, se mapearán los COG identificados en las vías KEGG. Además del núcleo microbiano común, las diferencias entre individuos y entre dietas se determinarán en términos de función metabólica.
• ACTIVIDAD IV. Caracterización funcional. La caracterización de algunas características funcionales de muestras fecales y de aislados microbianos de muestras fecales fortalecerá el vínculo entre la dieta y la microbiota intestinal.
• AIV.1 Actividades genotóxicas y antigenotóxicas fecales (RU 5) Se prepararán muestras de agua fecal (FW) y se determinará la genotoxicidad mediante el ensayo Comet. Los enterocitos HT29 (10^6 células/ensayo) coexpuestos a FW e incorporados en el portaobjetos LMA se someterán a electroforesis en gel de una sola célula (SCGE) y se analizarán mediante epifluorescencia. Se investigará la actividad inhibitoria de varios aislados microbianos de los alimentos frente a compuestos genotóxicos y mutagénicos, que están potencialmente presentes en el intestino. El efecto de la co-incubación microorganismo-genotoxina se ensayará mediante la evaluación de la actividad genotóxica residual de los compuestos mediante el SOS-Chromotest (diana Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) y, en paralelo, el ensayo Comet (diana enterocitos HT29 ).
• AIV.2. Microorganismos fecales y modulación de la respuesta inmune (RU 9) Las condiciones de crecimiento y diferenciación de las células dendríticas (DC) y las células Caco-2 se establecerán en los primeros meses de actividad. Se aislarán lactobacilos y bifidobacterias de todas las muestras fecales y se utilizarán como bacterias irradiadas para detectar la expresión de mediadores inmunitarios en los enterocitos. Se determinarán los niveles de secreción de proteínas transcritas y afines de IL-8 y TGF-beta tolerogénico (factor de crecimiento transformante beta) y TSLP (linfopoyetina estromal tímica). Las bacterias irradiadas también se utilizarán para estimular los marcadores de superficie en las células DC. El ARN total se extraerá de las células Caco-2 y DC, y el ADNc se preparará para observar la expresión génica relativa de IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 e IL-10; la concentración de los productos génicos correspondientes se determinará mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas).
• ACTIVIDAD V. Metaboloma de saliva, heces y orina (RU10). Para completar el enfoque "ómico", se analizará el metaboloma de muestras de heces, orina y saliva con tres técnicas (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Atenuated Total Reflectance) y NMR (Resonancia magnética nuclear) según los protocolos previamente establecidos. Los compuestos químicos se identificarán utilizando bases de datos de espectros de masas, así como datos de espectros de masas en la literatura y/o datos de compuestos químicos puros. Al descongelar las muestras de orina y saliva, el análisis de RMN se realizará dentro de las 2 h. Las muestras fecales se prepararán dando la máxima importancia a la recuperación completa de las moléculas hidrosolubles. Los espectros de RMN se prepararán para el análisis estadístico mediante la corrección de las desalineaciones de los pequeños picos a través del algoritmo iCoshift.
• ACTIVIDAD VI. Elaboración estadística de los resultados (todas las EE. UU.). Durante el desarrollo del proyecto, RU2 se encargará del mantenimiento del sitio web en colaboración con el socio CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), el sitio recopilará todos los resultados de las diferentes actividades de investigación. Esta base de datos se utilizará para el análisis en "modo R" para evaluar el impacto de varios descriptores en la determinación de la diversidad de las tres dietas, y en "modo Q" para determinar la diferencia entre las tres dietas. Al mismo tiempo, los resultados más relevantes se difundirán a través de publicaciones científicas en revistas revisadas por pares.

Teniendo en cuenta el tema a estudiar, este proyecto sin duda ha aplicado aspectos potenciales. Por ejemplo, el conocimiento del efecto de la dieta sobre la microbiota humana podría resultar en la elaboración de guías adecuadas para ser distribuidas en campañas de promoción de la atención integral. Se cuidarán las preferencias, actitudes, necesidades, comportamiento, estilo de vida y educación de los consumidores, y se mejorará la comunicación entre los consumidores y la comunidad de investigación de la cadena alimentaria para mejorar la elección informada y su impacto en la calidad de vida. Empoderar a las personas para que mejoren y manejen su salud a través de hábitos dietéticos correctos resultará en un ahorro de costos para los sistemas de salud.