Microbiota en gerelateerd metaboloom in alleseters, vegetarische of veganistische diëten (MRMOVVD)

De algemene doelstelling van dit project is het vinden van de relatie tussen voeding en speeksel en fecale microbiota, door middel van high-throughput en geïntegreerde meta-omics (genomische, transcriptomische, proteomische en metabolomische) analyses. Verschillende vragen worden in dit kader nog besproken. Wat is bijvoorbeeld de dagelijkse inname van microben en hun rol op de balans van de darmmicrobiota? Hoe wordt de darmmicrobiota beïnvloed door de belangrijkste soorten voeding (omnivoor, vegetarisch en veganistisch)? Welke zijn de heersende microbiële groepen op darmniveau, afhankelijk van het soort dieet? Wat is de vermoedelijke bijdrage van elke microbiële groep aan het behoud van de gezondheid van de gastheer? De kwantitatieve en kwalitatieve bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in voedingsmiddelen, afhankelijk van voedingsgewoonten, beantwoordt aan een eerdere vraag en valt samen met een van de doelstellingen van dit project. De schatting van de diversiteit (genomics), functionele activiteit (transcriptomics en proteomics) en metabolieten (metabolomics) van met name de fecale microbiota valt samen met de holistische benadering van dit project en beantwoordt verschillende van de eerdere vragen. Gezien de nauwe correlatie tussen de balans van verschillende microbiële populaties in verschillende niches van het menselijk lichaam en het begin van metabole pathologieën, zal dit project nieuwe kennis opleveren die mogelijke relaties tussen voeding en desmetabolismen kan benadrukken. Dieet moet worden beschouwd als het meest geschikte en goedkope instrument om een ​​stabiele en gunstige orale en intestinale microbiota te bepalen, die ziekten voorkomt en de menselijke levensduur garandeert. Deze algemene doelstellingen van het project zullen worden bereikt op basis van specifieke doelstellingen, zoals: (i) de identificatie van biologische, moleculaire en metabolische markers die specifiek zijn voor het soort dieet; (ii) de schatting van de verschillen in de microbiota en het metaboloom van speeksel en ontlasting, zowel tussen individuen als tussen soorten voeding; (iii) de schatting van de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in de microbiële inname verbonden aan het soort dieet; en (iv) de identificatie van de functionele kenmerken van fecesmonsters gerelateerd aan het type dieet, die kunnen worden beschouwd als indicatoren van ziektegevoeligheid.

Om de algemene doelstelling van dit project te bereiken, zijn tien onderzoekseenheden (RU's; RU1-10) betrokken bij het voorstel, met het partnerschap van 16 nationale en vooral buitenlandse instellingen, die 12 verschillende landen bestrijken. De leiders van elke spoorwegonderneming worden hieronder vermeld:

• RU1. Marco Gobbetti is de hoofdonderzoeker van het voorstel en leider van RU1. Volgens ISI Web of Science is hij auteur van 188 publicaties die 4.075 keer werden geciteerd, met een gemiddelde van citaties per publicatie van 21,68 en een h-index van 39. Hij is onlangs opgenomen in de Top Italian Scientists door VIA Academy (jaarlijkse evaluatie voor wetenschappers met een waarde van h-index hoger dan 30). De RU1 heeft goede ervaring opgedaan met de studie van de darmmicrobiota van coeliakiepatiënten, en met de proteomics toegepast op melkzuurbacteriën en voedingsmiddelen. RU1 zal de rol van coördinator van het project vervullen. Binnen dit project houdt RU1 zich bezig met: werving van vrijwilligers; administratie van agenda's; behandeling en voorbereiding van biologische monsters; bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in de fecesmonsters door middel van cultuurafhankelijke methoden; meta-proteomics-karakterisering van geselecteerde fecale monsters van individuen met verschillende voedingsgewoonten; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal de RU1 samenwerken met het Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Spanje, voor de specifieke toekenning van functionele activiteiten en/of metabole routes aan geïdentificeerde eiwitten en met het Department of Microbiologie van het University College Cork, Ierland, voor de bioinformatische benadering van proteoomstudies.
• RU2. Gianluigi Cardinali is de leider van RU2. Zoals gemeld door ISI Web of Science, is hij auteur van 38 publicaties met een h-index van 11. De RU2 is sinds ongeveer twintig jaar actief op het gebied van biodiversiteit en taxonomie van gisten, die worden geanalyseerd door middel van microbiologische en moleculaire technieken. Binnen dit project houdt RU2 zich bezig met: karakterisering van de diversiteit van de voedselmicrobiota door middel van PCR-DGGE-benadering; karakterisering van de microbiota van fecale monsters door middel van PCR-DGGE-benadering; en, als leider, in het beheer van de statistische uitwerking van de resultaten van alle spoorwegondernemingen, door een gemeenschappelijke database te bieden. De RU2 gaat samenwerken met het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Nederland, voor de bioinformatische uitwerking van de data.
• RU3. Danilo Ercolini is de leider van RU3. Volgens ISI Web of Science is hij auteur van 58 publicaties, met een totaal aantal citaties van 1.354 en een h-index van 21. De RU3 is al jaren betrokken bij studies naar de microbiële ecologie van complexe ecosystemen, voornamelijk voedselecosystemen. De voedselmicrobiota is altijd bestudeerd door geavanceerde moleculaire benaderingen en door cultuuronafhankelijke methoden die geen kweek van micro-organismen op synthetische media vereisen. Binnen dit project houdt RU3 zich bezig met: karakterisering van de diversiteit van de microbiota in speekselmonsters; diepe sequencing van geselecteerde voedselmonsters; diepe sequencing van geselecteerde feces- en speekselmonsters; meta-genomics karakterisering van geselecteerde fecale monsters van individuen met verschillende voedingsgewoonten; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal de RU3 samenwerken met het Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) dat wordt uitgevoerd in het Argonne National Laboratory, Lemont, Verenigde Staten, om datasets te creëren die micro-organismen uit een breed scala aan ecosystemen beschrijven.
• RU4. Erasmo Neviani is de leider van RU4. Volgens ISI Web of Science is hij auteur van 111 publicaties, met een totaal aantal citaties van 1.508 en een h-index van 22. De RU4 heeft goede ervaring opgedaan in voedselmicrobiële ecologie voor een uitgebreide en geïntegreerde evaluatie van de microbiële populaties, dynamiek en fysiologische status van cellen in verschillende stadia van voedselproductie. Binnen dit project houdt RU4 zich bezig met: opstellen van agenda's; werving van vrijwilligers; administratie van agenda's; behandeling en voorbereiding van biologische monsters; bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in de fecesmonsters door middel van cultuurafhankelijke methoden; uitwerking van de resultaten uit dagboeken; bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in voedingsmiddelen door middel van cultuurafhankelijke en -onafhankelijke methoden; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal de RU4 samenwerken met het Department of Food Science and Technology van de Landbouwuniversiteit van Athene, Griekenland, voor de microbiële bepaling in voedingsmiddelen en vooral in zuivelproducten, met de Epidemiologie-eenheid van de Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori uit Milaan, Italië, voor de hulp bij het registreren van voedingsgewoonten, en met het National Institute for Food and Nutrition Research in Rome, Italië, voor het monitoren van de vermeende tekortkomingen in verband met restrictieve voedingsregimes.
• RU5. Aldo Corsetti is de leider van RU5. Volgens ISI Web of Science is hij auteur van 81 publicaties met een totaal aantal citaties van 2.084 en een h-index van 28. RU5 heeft goede ervaring opgedaan op het gebied van microbiële ecologie van voedsel en dranken, evenals op het gebied van karakterisering van stammen voor biotechnologische en functionele aspecten, om starterculturen voor verschillende toepassingen te selecteren. Binnen dit project houdt RU5 zich bezig met: bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in voedingsmiddelen door middel van cultuurafhankelijke methoden; identificatie en typering van microbieel geïsoleerd uit voedsel; karakterisering van de genotoxiciteit van fecesmonsters; karakterisering van de anti-genotoxigene activiteit van microbiële isolaten uit voedingsmiddelen; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal de RU5 samenwerken met het Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, Canada, voor moleculaire typering van voedselgeïsoleerde micro-organismen door middel van een multi-locus sequencing.
• RU6. Patrizia Brigidi is de leider van RU6. Zoals gerapporteerd door ISI Web of Science, is ze auteur van 102 publicaties die 3.158 keer werden geciteerd, met een gemiddelde van citaties per publicatie van 32,41 en een h-index van 26. RU6 heeft een geconsolideerde en brede competentie op het gebied van identificatie en moleculaire kwantificering van bacteriën uit complexe ecosystemen (faeces en darmbiopten) en op het gebied van moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor gezondheidsvoordelen van bacteriën. Binnen dit project houdt RU6 zich bezig met: werving van vrijwilligers; administratie van agenda's; behandeling en voorbereiding van biologische monsters; bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in de fecesmonsters door middel van cultuurafhankelijke methoden; meta-transcriptomics karakterisering van geselecteerde fecale monsters van individuen met verschillende voedingsgewoonten; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal de RU6 samenwerken met de Food Microbial Science Unit, University of Reading, Verenigd Koninkrijk, voor de ontwikkeling van het metatranscriptomische platform en voor de bioinformatische analyse van de verkregen sequenties voor hun toewijzing aan KEGG en COG cluster van functionele activiteiten.
• RU7. Francesca Clementi is de leider van RU7. Zoals gemeld door ISI Web of Science, is ze auteur van 59 publicaties die 504 keer werden geciteerd, met een gemiddelde van citaties per publicatie van 11,25 en een h-index van 15. De RU7 heeft een betrouwbare expertise met betrekking tot de rol, monitoring en controle van door voedsel overgedragen micro-organismen, met name melkzuurbacteriën. Binnen dit project houdt RU7 zich bezig met: karakterisering van de diversiteit van de voedselmicrobiota door middel van PCR-DGGE; bepaling van de antibioticaresistentie in ontlastings- en speekselmonsters; isolatie en identificatie van antibioticaresistente melkzuurbacteriën uit feces- en speekselmonsters; karakterisering van de genen die betrokken zijn bij de microbiële antibioticaresistentie; studie van de mechanismen voor de overdracht van antibioticaresistentie tussen bacteriën; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal de RU7 samenwerken met de Griekse Democritus Universiteit van Thracië, Griekenland, en met het Rowett Instituut voor Voeding en Gezondheid van de Universiteit van Aberdeen, Schotland, aan het onderzoek naar overdraagbare antibioticaresistentiegenen in voedsel en geïsoleerde melkzuurbacteriën. van speeksel- en ontlastingsmonsters.
• RU8. Luca Simone Cocolin is de leider van RU8. Zoals gerapporteerd door Scopus, is hij auteur van 131 publicaties die 2.036 keer werden geciteerd, resulterend in een h-index van 25. De RU 8 heeft ruime ervaring met het toepassen van cultuuronafhankelijke methoden voor de studie van microbiële biodiversiteit en vitaliteit in gefermenteerde voedingsmiddelen. Het heeft ook kennis van kwantitatieve PCR (qPCR) voor het kwantificeren van specifieke micro-organismen uit complexe ecosystemen. Binnen dit project houdt RU8 zich bezig met: werving van vrijwilligers; administratie van agenda's; behandeling en voorbereiding van biologische monsters; bepaling van de belangrijkste microbiële groepen in de fecesmonsters door middel van cultuurafhankelijke methoden; profilering van de fecale microbiota door DGGE-benaderingen toegepast op zowel DNA- als RNA-niveau; meta-genomische karakterisering van geselecteerde fecale monsters van individuen met verschillende voedingsgewoonten; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal RU8 samenwerken met de Universiteit van Maribor (UM), Slovenië, en de Democritus Universiteit van Thracië (DUT), Alexandroupolis, Griekenland, voor aspecten die te maken hebben met de interactie van pathogenen-gastheercellen en voor mogelijke modificaties van de dieet van de verschillende dieetgroepen, die het beste gebruik kunnen maken van de bekende gunstige rol van bepaalde microbiële groepen die geassocieerd zijn met specifieke voedingsmiddelen.
• RU9. Mauro Rossi is de leider van RU9. Volgens ISI Web of Science is hij auteur van 41 publicaties, met een totaal aantal citaties van 1087 en een h-index van 19. De RU9 heeft een jarenlange ervaring (>25 jaar) en sterke samenwerkingen op het gebied van de biochemie en immunologie van de dunne darm. Binnen dit project houdt RU9 zich bezig met: isolatie van lactobacillen en bifidobacteriën uit fecesmonsters; karakterisering van de in vitro immuunrespons van fecale isolaten met behulp van Caco-2-cel; karakterisering van de in vitro immuunrespons van fecale isolaten met behulp van dendritische cellen; meting van cytokinesecretie in Caco-2 en dendritische cellen; en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal RU9 samenwerken met de Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, Spanje (bijlage in model B), om vast te stellen of eigenaardigheden in fecale microbiota een rol kunnen spelen bij het ontstaan ​​van intestinale immuundisfuncties.
• RU10. Lucia Vannini is de leider van RU10. Zoals gemeld door ISI Web of Science, is zij de auteur van 27 publicaties met een totaal aantal citaties van 322 en een h-index van 9. De RU10 heeft een goede ervaring opgedaan zowel op het gebied van voedselmicrobiologie als in het gebruik van instrumentele technieken, en in het bijzonder nucleaire magnetische resonantie, voor metaboloomanalyse van biologische monsters. Binnen dit project houdt RU10 zich bezig met: metaboloomkarakterisering van geselecteerde voedingsmiddelen; metaboloomkarakterisering van speekselmonsters; metaboloomkarakterisering van feces- en urinemonsters en statistische uitwerking van de resultaten. Binnen dit project zal R10 samenwerken met het Zweedse Instituut voor Voedsel en Biotechnologie, Zweden, en het Instituut voor Chemische Technologie, Afdeling Onderzoek en Ontwikkeling, Praag, Tsjechische Republiek, respectievelijk voor aspecten betreffende de metabolomische karakterisering van sommige geselecteerde voedingsmiddelen en biologische monsters. De toegepaste cascadebenadering maakt elke onderzoeksactiviteit en elke spoorwegonderneming onmisbaar om de hoofddoelstellingen van het project te bereiken.

Deze studie zal worden samengesteld door verschillende activiteiten (AI-VI) die hieronder worden beschreven:

• ACTIVITEIT I. Rekrutering van personen, administratie van dagboeken, behandeling, voorbereiding en opslag van biologische monsters, en microbiologische analyses van fecale monsters.
• AI.1. Werving van individuen en administratie van dagboeken (RU1, 4, 6, 8) Ongeveer 50 omnivoor, vegetarische en veganistische vrijwilligers, voor een totaal van 150 proefpersonen zullen worden aangeworven.Vegetarische en veganistische individuen zullen worden aangeworven met medewerking van de Italiaanse Wetenschappelijke Vereniging van vegetarische voeding. Omnivore-individuen zullen worden geworven via advertenties die op de universiteiten worden gepubliceerd. Er zullen ongeveer 50 gezonde vrijwilligers worden aangeworven, waaronder een ongeveer gelijk aantal omnivoren, vegetariërs en veganisten (leeftijd 18-59 jaar, verhouding man/vrouw ca. 1:1). Aangeworven vrijwilligers zullen worden gevraagd een consensusdocument te ondertekenen om hun voedingsgewoonten vast te leggen. De dagboeken zullen uitgebreid zijn om gedetailleerde informatie over voedselkenmerken te krijgen, waardoor een gemakkelijke identificatie van de producten op de markt en een schatting van de vermoedelijke ingenomen microbiële lading mogelijk wordt. De Ethische Commissie van de Universiteiten wordt geïnformeerd voordat het project van start gaat.
• AI.2. Behandeling, voorbereiding en opslag van biologische monsters (RU1, 4, 6, 8). Elk individu levert wekelijks monsters van speeksel, ontlasting en urine gedurende een periode van drie weken. Monsters in drievoud zullen vóór analyses worden samengevoegd om de intra-individuele variabiliteit te beperken. Afhankelijk van het type biologische monsters (speeksel, feces, urine) en daaropvolgende analyses (bijv. DNA, RNA, proteoom) zal de behandeling anders worden uitgevoerd. Gelijktijdig met het werven van individuen en het verzamelen van biologische monsters, zullen de meeste SO's betrokken zijn bij het opzetten van de technieken/methoden.
• AI.3. Microbiologische analyses van fecale monsters (RU1, 4, 6, 8). In de eerste keer zullen de levensvatbare tellingen worden uitgevoerd door vers fecaal materiaal uit te platen op verschillende selectieve kweekmedia, om de meest voorkomende fecale microbiële groepen op te sommen.
• AI.4. Opzetten van technieken/methoden (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Gelijktijdig met het werven van individuen en het verzamelen van biologische monsters, zullen de meeste SO's betrokken zijn bij het opzetten van de technieken/methoden. Om een ​​onafhankelijk en concurrerend platform voor meta-omics-analyses op te zetten, zal RU3 apparatuur aanschaffen voor high-throughput sequencing, wat een belangrijke economische investering in dit project is.
• ACTIVITEIT II. Voedselmicrobiota en metaboloom. Op basis van de informatie uit voedingsdagboeken worden de meest representatieve voedingsmiddelen van de 3 diëten opgesplitst in 3 categorieën: (i) laag (TBC, 10^3 kve/g); (ii) intermediair (TBC 10^3 - 10^6 kve/g); en (iii) hoge (TBC ³ 10^6 cfu/g) microbiële belasting. Voor voedingsmiddelen van groep (i) zal het aantal bacteriën worden geschat op basis van literatuurgegevens. Voor voedingsmiddelen van groep (ii) en (iii) zal het microbiële aantal worden bepaald op basis van literatuurgegevens in het geval van bekende producten met weinig marktdifferentiatie (bijv. Parmigiano Reggiano-kaas), terwijl passende analyses zullen worden uitgevoerd in het geval van producten met grote marktvariabiliteit (bijv. Mozzarella-kaas). In het laatste geval zullen de analyses betrekking hebben op een groot aantal producten die op de markt verkrijgbaar zijn. De microbiële diversiteit van voedingsmiddelen zal eerst grondiger worden bestudeerd door middel van PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel-elektroforese) en indien nodig door diepe sequencing op basis van het niveau van complexiteit en huidige kennis van de microbiota van de specifieke voedingsmiddelen.
• AII.1 Kwantitatieve bepaling van micro-organismen in voedingsmiddelen (RU 4, 5; 7). De analyse van voedingsmiddelen zal worden gedeeld tussen RU4 en 5, en sommige monsters zullen door beide RU worden geanalyseerd om de resultaten wederzijds te valideren. Vervolgens zal RU4 geselecteerde voedingsmiddelen karakteriseren door middel van LH-PCR-analyse (Length Heterogenity Polymerase Chain Reaction), en de resultaten zullen worden vergeleken met die verkregen door RU7 met behulp van PCR-DGGE. RU5 zal een grote verzameling isolaten uit voedingsmiddelen identificeren, gericht op het vinden van mogelijke relaties met een verminderde anti-genotoxische activiteit van het fecale water en de aanwezigheid van specifieke micro-organismen in het ingenomen voedsel.
• AII.2 Microbiële diversiteit in voedingsmiddelen (RU 2, 3). Ten eerste zal deze activiteit slecht gekarakteriseerd voedsel overwegen dat specifiek wordt gegeten door vegetariërs en veganisten op basis van gegevens uit dagboeken. Zowel de micro- als de micobiota zullen worden onderzocht. PCR-DGGE-analyses voor gisten en filamenteuze schimmels zullen gebaseerd zijn op de amplificatie van delen van het D1/D2-domein die coderen voor de subeenheid LSU of 26S van het rRNA, en de ITS-regio's (Internal Transcribed Spacer). Het V3-gebied van het 16S-rRNA-gen zal worden gericht om bacteriën te detecteren. Na DGGE-analyse worden de resulterende gels gedigitaliseerd en geanalyseerd door de software Bionumerics. Dendrogrammen zullen worden onderworpen aan clusteranalyse om die monsters uit te sluiten van de verdere sequentiëring met een overeenkomstcoëfficiënt van 85%; een dergelijke selectie bespaart de kosten van de volgende generatie sequencing en zorgt ervoor dat er een beheersbare hoeveelheid gegevens wordt verkregen die via bio-informatica moet worden geanalyseerd. RU3 zal de diepe sequencing uitvoeren met behulp van bibliotheken van amplicons van variabele genen van taxonomisch belang en met behulp van specifieke procedures volgens het type sequencingplatform dat zal worden gekocht. De resultaten van de sequencing zullen op bioinformatische basis worden uitgewerkt door de RU2.
• AII.3 Voedselmetaboloom (RU 10). Op basis van de informatie over voedingsgewoonten zullen de gefermenteerde voedingsmiddelen die het meest vertegenwoordigd zijn in de drie diëten, worden geanalyseerd om een ​​mogelijke relatie te vinden tussen ingenomen chemische verbindingen (bijv. Salycilzuur) en vermoedelijk teruggevonden in biologische monsters. De metaboloomanalyses zullen uitgevoerd worden door middel van GC-MS/SPME (Gaschromatografie-massaspectrometrie /solid-phase micro-extractie) en FTIR (Fourier Transform Infrared) spectroscopie.
• ACTIVITEIT III. De microbiota van uitwerpselen en speeksel. Voorlopig zijn alle speeksel- en ontlastingsmonsters van alle ca. 150 vrijwilligers zullen worden onderworpen aan PCR-DGGE-analyses om een ​​overzicht te krijgen van de microbiële diversiteit. RT-PCR-DGGE (Real Time- Polymerase Chain Reaction- Denaturing gradient gel electrophoresis) zal ook worden overwogen om levensvatbare populaties in feces te schatten. Op basis van deze analyses zullen representatieve monsters van elke voedingsgewoonte worden onderworpen aan next generation sequencing. De output van al deze resultaten zou het mogelijk moeten maken om stap voor stap 4/5 fecale monsters te selecteren voor elk van de drie diëten die aan meta-omics-analyses moeten worden onderworpen.
• ACTIVITEIT III.1. Studie van de biodiversiteit.
• AIII.1.1. PCR-DGGE-profilering (RU 2, 3, 8) PCR-DGGE-analyses voor gisten en draadschimmels zullen gericht zijn op 26S-rRNA- en ITS-regio's, terwijl V3- en/of V6-V8-regio's van het 16S-rRNA op bacteriën zullen worden bestudeerd. Zowel DNA als RNA (na RT-PCR) zullen gebruikt worden als doelwit om respectievelijk totale en levensvatbare populaties te onderzoeken. Onder dezelfde experimentele omstandigheden zal RU3 de bacteriële diversiteit van speekselmonsters karakteriseren. Na DGGE-, beeld- en clusteranalyses van DNA- en RNA-monsters zal het mogelijk zijn om een ​​verschil te definiëren tussen de globale en levensvatbare populatie. De dendrogrammen van gelijkenis zullen worden gebruikt om die monsters uit te sluiten van de verdere sequentiebepalingsactiviteit met een gelijkeniscoëfficiënt ³ 85%; een dergelijke selectie zal de kosten van de volgende generatie sequencing-analyses besparen, en zal ervoor zorgen dat een beheersbare hoeveelheid gegevens wordt geanalyseerd via bio-informatica.
• AIII.1.2. Next Generation Sequencing (RU 3, 8) Diepe sequencing op geselecteerde speeksel- en fecale monsters zal worden uitgevoerd met behulp van bibliotheken van amplicons van variabele genen van taxonomisch belang. Alle verkregen sequentieresultaten voor zowel bacteriën als schimmels zullen op bioinformatische basis worden uitgewerkt door de RU2.
• AIII.1.3. Antibioticaresistentie (RU 7) DNA dat rechtstreeks uit speeksel- en ontlastingsmonsters wordt geëxtraheerd, zal met behulp van PCR-assays worden gescreend op het voorkomen van genen die coderen voor resistentie tegen verschillende antibiotica. Monsters die positief zijn bevonden voor antibioticaresistentie (AR)-genen, zullen worden gebruikt om antibioticaresistente lactobacillen, lactokokken en enterokokken te isoleren. Na identificatie zullen isolaten die waarden van minimale remmende concentratie (MIC) vertonen die hoger zijn dan de overeenkomstige breekpunten worden bevestigd door PCR-amplificatie van de overeenkomstige AR-genen. De mogelijkheid om AR-genen gelokaliseerd op genetische mobiele elementen over te brengen van isolaten naar bacteriën van klinisch belang zal worden geëvalueerd door middel van conjugatieproeven.
• AIII.2. Meta-omics-analyses van geselecteerde fecale monsters Volgens de cascadebenadering zullen de resultaten van de studie van de microbiële diversiteit van fecale monsters 4/5 individuen selecteren die representatief zijn voor elk van de 3 soorten voeding (4/5 x 3 = 12/ 15) om te worden onderworpen aan meta-omics-analyses. De meta-omics-benaderingen zullen een interne database opleveren, bestaande uit de DNA- en RNA-sequenties van de fecale microbiomen van de 12/15 individuen, die een volledig beeld van de gesynthetiseerde eiwitten mogelijk zullen maken.
• AIII.2.1. Meta-genomics (RU3, 8) Fecaal DNA zal worden gekwantificeerd en een shotgun-sequencingprotocol zal worden toegepast voor meta-genomische analyse. Deze taak zou moeten worden uitgevoerd door de RU3, afhankelijk van de prestaties en beschikbaarheid van het sequencing-platform, dat zich fulltime zal bezighouden met de analyse van DNA- en cDNA-amplicons van ontlasting en speeksel. Als alternatief zullen gespecialiseerde bedrijven deze taak als een dienst uitvoeren.
• AIII.2.2. Meta-transcriptomics (RU 6) Het algemene microbiële genexpressieprofiel zal worden gekarakteriseerd met behulp van een innovatieve, op Illumina gebaseerde Metatranscriptomic-benadering en het protocol dat tijdens de eerste maanden van het project is opgezet. cDNA zal worden gesinterd uit RNA volgens geoptimaliseerde procedures. Willekeurige amplificatie van het cDNA zal worden uitgevoerd en de cDNA zal worden gesequenced met behulp van het Illumina HiSeq-platform. De meta-transcriptomen waarvan de sequentie is bepaald, zullen worden samengevoegd met behulp van Velvet/MetaVelvet- of SOAPdenovo-pakketten om de grootst mogelijke consensussequentie te bereiken. De transcriptsequenties zullen worden geannoteerd met behulp van gevestigde pijplijnen en transcripten zullen worden doorzocht met behulp van RPS-BLAST (Reversed Position Specific-Basic Local Alignment Search Tool) tegen KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) en de Genbank-databases. Bacterie-achtige reads geïdentificeerd door nr BLASTX zullen verder worden doorzocht in de COG-database. De functionele rollen van de sequenties worden toegewezen op basis van de KEGG- en COG-zoekopdrachten.
• AIII.2.3. Meta-proteomics (RU1) Op basis van de workflow die binnen de eerste maanden van activiteit is ontworpen, zullen eiwitten uit elk fecaal monster worden geëxtraheerd en worden geanalyseerd met gelvrije en/of op gel gebaseerde proteomics. De identificatie van peptiden zal worden uitgevoerd met behulp van de massaspectrometer Finnigan LCQ Deca XP MAX. Differentiële proteomische analyse zal worden uitgevoerd. Voor peptide-identificatie zal het Open Mass Spectra Search Algorithm worden gebruikt om MS/MS-spectra te doorzoeken aan de hand van de beschikbare databases. Om verdere functionele informatie op te halen, zullen de eiwitten op basis van COG-classificatie worden geannoteerd. De geïdentificeerde COG's worden in kaart gebracht op de KEGG-database met metabole routes en gevisualiseerd door de online applicatie van iPath. Na FDR-correctie worden alle geïdentificeerde peptiden doorzocht tegen UniProtKB en vervolgens in kaart gebracht. Om het hoogste functionele niveau van alle geïdentificeerde eiwitten aan te pakken, zullen de geïdentificeerde COG's op KEGG-routes in kaart worden gebracht. Naast de gemeenschappelijke microbiële kern, zullen inter-individuele en inter-dieet verschillen bepaald worden in termen van metabolische functie.
• ACTIVITEIT IV. Functionele karakterisering. De karakterisering van enkele functionele kenmerken van fecale monsters en van microbiële isolaten van fecale monsters zal de link tussen voeding en intestinale microbiota versterken.
• AIV.1 Fecale genotoxische en anti-genotoxische activiteiten (RU 5) Monsters van fecaal water (FW) zullen worden bereid en de genotoxiciteit zal worden bepaald door middel van Comet assay. De HT29-enterocyten (10^6 cellen/assay) die gelijktijdig zijn blootgesteld aan FW en zijn opgenomen in het LMA-objectglaasje, zullen worden onderworpen aan eencellige gelelektroforese (SCGE) en worden geanalyseerd door middel van epifluorescentie. Verschillende microbiële isolaten uit voedingsmiddelen zullen onderzocht worden op hun remmende werking op genotoxische en mutagene verbindingen, die potentieel aanwezig zijn in de darm. Het effect van de co-incubatie van micro-organismen en genotoxine zal worden getest door de evaluatie van de resterende genotoxische activiteit van de verbindingen met behulp van de SOS-Chromotest (target Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) en, parallel, de Comet-assay (target enterocyten HT29 ).
• AIV.2. Fecale micro-organismen en modulatie van de immuunrespons (RU 9) De voorwaarden voor groei en differentiatie van dendritische cellen (DC) en Caco-2-cellen zullen worden gecreëerd binnen de eerste maanden van activiteit. Lactobacilli en bifidobacteriën zullen worden geïsoleerd uit alle fecale monsters en worden gebruikt als bestraalde bacteriën om de expressie van immuunmediatoren in enterocyten te detecteren. Transcript en verwante eiwituitscheidingsniveaus van IL-8 en tolerogene TGF-beta (Transforming growth factor beta) en TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin) zullen worden bepaald. Bestraalde bacteriën zullen ook worden gebruikt om oppervlaktemarkers in DC-cellen te stimuleren. Totaal RNA zal worden geëxtraheerd uit de Caco-2- en DC-cellen en cDNA zal worden bereid om te kijken naar de relatieve genexpressie van IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alpha, IL-12p40 en IL-10; de concentratie van de overeenkomstige genproducten zal worden bepaald met ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIVITEIT V. Speeksel-, fecaal- en urinemetaboloom (RU10). Om de "omics"-benadering te vervolledigen, zal het metaboloom van monsters van ontlasting, urine en speeksel worden geanalyseerd met drie technieken (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) en NMR (Nuclear Magnetic Resonance). volgens de eerder opgestelde protocollen. Chemische verbindingen zullen worden geïdentificeerd met behulp van massaspectra-databases, evenals massaspectragegevens in de literatuur en/of gegevens van zuivere chemische verbindingen. Na ontdooien van urine- en speekselmonsters wordt de NMR-analyse binnen 2 uur uitgevoerd. Fecale monsters zullen worden bereid waarbij het grootste belang wordt gehecht aan het volledig herstel van in water oplosbare moleculen. De NMR-spectra zullen worden voorbereid voor statistische analyse door de foutieve uitlijning van de kleine pieken te corrigeren met behulp van het iCoshift-algoritme.
• ATTIVITEIT VI. Statistische uitwerking van de resultaten (alle SO's). Tijdens de projectontwikkeling zorgt RU2 voor het onderhoud van de website in samenwerking met partner CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), de site verzamelt alle resultaten van de verschillende onderzoeksactiviteiten. Deze database zal worden gebruikt voor analyse in "R-modus" om de impact van verschillende descriptoren te beoordelen bij het bepalen van de diversiteit van de drie diëten, en in "Q-modus" om het verschil tussen de drie diëten te bepalen. Tegelijkertijd zullen de meest relevante resultaten via wetenschappelijke publicaties worden verspreid in collegiaal getoetste tijdschriften.

Rekening houdend met het te bestuderen onderwerp, heeft dit project ongetwijfeld potentiële aspecten toegepast. De kennis van het effect van voeding op de menselijke microbiota zou bijvoorbeeld kunnen leiden tot het opstellen van geschikte richtlijnen die kunnen worden verspreid in campagnes voor bevordering van geïntegreerde zorg. Er zal rekening worden gehouden met de voorkeuren, houdingen, behoeften, gedragingen, levensstijl en opvoeding van consumenten, en de communicatie tussen consumenten en de onderzoeksgemeenschap van de voedselketen zal worden verbeterd om een ​​geïnformeerde keuze en de impact ervan op de levenskwaliteit te verbeteren. Door individuen in staat te stellen hun gezondheid te verbeteren en te beheren door middel van juiste voedingsgewoonten, kunnen kosten worden bespaard voor de gezondheidszorg.